高效液相色谱波长切换法同时测定归芍调经片中9种成分的含量

黄林杰，林华（.梧州市食品药品检验所生测室，广西 梧州 54300；.柳州市食品药品检验所，广西 柳州 545000）

归芍调经片由柴胡、白芍、白术、茯苓、当归、川芎、泽泻等7 味中药制成的中药复方制剂，具有疏肝理脾、调经止带功效，用于肝郁脾虚证、月经不调、小腹疼痛、带下色黄量多[1]。方中柴胡具有疏散退热、疏肝解郁和升举阳气等功效，柴胡中含有五环三萜类皂苷100 多种，其中柴胡皂苷a、d 含量较高[2-3]，且柴胡皂苷a 活性较强[4]。白芍具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[5]，白芍总苷是其有效部位，其中以芍药苷和芍药内酯苷为特征性成分[6-7]。白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎功效，其主要药效成分为挥发性成分、多糖类、内酯类、黄酮类、苷类等，其中内酯类成分对肿瘤细胞有一定的抑制作用[8-9]。茯苓具有利水渗湿、健脾宁心之效，主要有效成分为茯苓三萜及茯苓多糖等，其中茯苓酸是主要的三萜酸[10]。泽泻具有利水渗湿、泄热、化浊降脂等功效，三萜类是其主要成分，其中23-乙酰泽泻醇B 为主要活性成分[11]。归芍调经片的现行标准中仅把白芍中的芍药苷作为指标成分，然而单一的指标质量控制难以体现中药复方制剂中多成分、多效应、多靶点的整体作用，不能全面反映制剂的质量。本研究结合参考文献[12-19]，首次采用HPLC 波长切换法同时测定归芍调经片中芍药内酯苷、芍药苷、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸、白术内酯Ⅱ的含量，为该品种的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate3000 高效液相色谱仪，包括HPG-3400SD 二元泵、WPS-3000TSL自动进样器、TCC-3000RS 柱温箱、DAD-3000 二极管阵列检测器、Chromeleon 7 色谱工作站（美国Thermo Fisher Scientific 公 司）；ABS-135S 型电子天平（d＝0.01 mg）、MS205DU 型电子天平（d＝0.001 mg）（瑞士梅特勒公司）；FP240 型鼓风干燥箱（德国Binder 公司）；DAT-27 超声波清洗机[鼎泰（湖北）生化科技设备制造有限公司]。

1.2 试药

芍药苷（批号：110736-201842，纯度：97.4%）、柴胡皂苷a（批号：110777-201711，纯度：91.1%）、柴胡皂苷d（批号：110778-201711，纯度：95.8%）、23-乙酰泽泻醇B（批号：111846-201705，纯度：99.7%）、白术内酯Ⅲ（批号：111978-201501，纯度：99.9%）、白术内酯Ⅰ（批号：111975-201501，纯度：99.9%）、白术内酯Ⅱ（批号：111976-201501，纯度：99.9%）对照品（中国食品药品检定研究院），芍药内酯苷（批号：170624）和茯苓酸（批号：160907）对照品（纯度≥98%，成都普菲德生物技术有限公司）。归芍调经片[华润三九（郴州）制药有限公司，规格：0.22 g/片，批号：18040360、18110970、19010920]；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国默克），其他试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～10 min，17%A；10 ～15 min，17%→45%A；15 ～18 min，45%→65%A；18 ～25 min，65%A；25 ～33 min，65%→83%A；33 ～40 min，83%→50%A；40 ～45 min，50%→17%A；45 ～50 min，17%A）；流速：0.8 mL·min－1；检测波长：0 ～10 min 232 nm（芍药内酯苷和芍药苷）；10 ～22 min 208 nm（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 和23-乙酰泽泻醇B）、22 ～32 min 220 nm（白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和茯苓酸）、32 ～50 min 278 nm（白术内酯Ⅱ）；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取各对照品适量，加甲醇使溶解，配制成每1 mL 含芍药内酯苷1.522 mg、芍药苷4.401 mg、柴胡皂苷a 0.252 mg、柴胡皂苷d 0.101 mg、23-乙酰泽泻醇B 0.026 mg、白术内酯Ⅲ0.804 mg、白术内酯Ⅰ0.752 mg、茯苓酸1.018 mg、白术内酯Ⅱ0.558 mg 的对照品储备液，精密量取各对照品储备液1 mL，置同一25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，室温避光保存，备用。

2.2.2 供试品溶液 取本品20 片，除去包衣，研细，精密称取本品细粉0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，室温超声处理（功率：700 W，频率：40 kHz）30 min后，取出放冷，称定质量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，用0.45 μm 滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法分别制备缺白芍、缺柴胡、缺泽泻、缺白术、缺茯苓的阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下，精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL 进样测定，结果各待测成分与前后峰分离度均大于1.5，对称因子在0.95 ～1.22，各测定成分理论塔板数均大于5000。阴性样品溶液色谱图中在与样品中芍药内酯苷、芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸、白术内酯Ⅱ保留时间相应位置上未见色谱峰，说明其他成分对测定无干扰，专属性较好。色谱图见图1。

图1 归芍调经片高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Guishao Tiaojing tablet

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 置于同一25 mL 量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（x，μg·mL－1），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，结果表明9 种成分在各自质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（见表1）。

表1 线性关系考察结果Tab 1 Linear range investigation

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果芍药内酯苷、芍药苷、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸、白术内酯Ⅱ峰面积的RSD分 别 为0.76%、0.23%、0.85%、0.67%、0.71%、0.64%、0.48%、0.39%、0.87%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：18040360），分别于制备后0、4、6、12、24、48 h 按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芍药内酯苷、芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸、白术内酯Ⅱ峰面积的RSD分别为0.31%、0.22%、0.78%、0.83%、0.69%、0.46%、0.53%、0.45%、0.74%（n＝6），表明供试品溶液48 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批供试品（批号：18040360），除去包衣后的细粉，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6 份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果芍药内酯苷、芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸、白术内酯Ⅱ含量的平均值分别为6.17、17.63、1.05、0.38、0.15、3.20、3.01、4.16、2.24 mg·g－1，RSD分别为0.42%、0.15%、0.53%、0.57%、0.74%、0.69%、0.79%、0.63%、0.94%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量的归芍调经片（批号：18040360）细粉，精密称取0.25 g，置于50 mL 棕色量瓶中，共6 份，分别加入“2.2.1”项下各对照品储备液1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算各成分加样回收率及其RSD值，平均加样回收率分别为97.1%、99.7%、97.4%、98.0%、96.6%、101.0%、98.5%、98.6%、95.5%，RSD（n＝6）分别为0.5%、0.6%、1.5%、0.8%、1.1%、0.8%、0.7%、0.4%、1.0%。

2.9 样品含量测定

按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取“2.2”项下供试品溶液进样测定，结果见表2。

表2 归芍调经片中9 种成分含量的结果(n ＝3，mg·g－1)Tab 2 Determination of 9 components in Guishao Tiaojing tablets (n ＝3，mg·g－1)

3 讨论

3.1 提取条件的选择

分别考察了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇作为提取溶剂，结果以70%甲醇溶液提取时，所测各成分的提取率相对较高，故选择70%甲醇作为提取溶剂；分别对供试品溶液采用超声提取、加热回流提取、索氏提取相同的时间，结果超声提取和索氏提取效果相当，综合考虑提取方法的稳定性及简便性，最终选择超声提取；分别比较了超声提取15、30、45 min，结果发现超声提取45 min 时，柴胡皂苷a的含量相对于30 min 时下降，可能与柴胡皂苷a化学性质不稳定易降解有关，通过比较确定超声时间为30 min。

3.2 流动相的选择

在流动相的选择上，分别考察了乙腈-水、乙腈-磷酸溶液（0.1%和0.05%）系统，结果以乙腈-水为流动相时，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅱ分离效果最佳，干扰少。而茯苓酸的峰形较宽，有拖尾现象；以乙腈-磷酸溶液为流动相时，芍药内酯苷、芍药苷能较好地分离，茯苓酸的峰形较佳，无拖尾现象，基线较平稳，综合考虑各因素选择乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，通过梯度洗脱，所测各成分都能很好地分离，且基线比较平稳，对称因子在0.95 ～1.22。

3.3 检测波长的选择

采用DAD 检测器对9 个活性成分在190 ～400 nm 波长段光谱扫描，结果显示，芍药苷和芍药内酯苷在232 nm 波长处有最大吸收，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 在210 nm 处有末端吸收，23-乙酰泽泻醇B 在208 nm 波长处有最大吸收，白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ在222 nm 波长处有最大吸收，白术内酯Ⅱ在278 nm 波长处有最大吸收，茯苓酸在210 波长处有最大吸收，由于过于频繁的切换波长，基线会有一定幅度的漂移，造成基线不稳定，所以最终选择在232 nm 波长处检测芍药苷和芍药内酯苷，在208 nm 波长处检测柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 和23-乙酰泽泻醇B，在220 nm 波长处检测白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和茯苓酸，在278 nm 波长处检测白术内酯Ⅱ。

3.4 小结

本研究建立了测定归芍调经片中芍药内酯苷、芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰泽泻醇B、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ、茯苓酸、白术内酯Ⅱ9 种成分的HPLC 分析方法，此方法简单、有效、稳定性好、准确度高，可为归芍调经片的质量控制和进一步的研究提供参考依据。