高效液相色谱法测定半枝莲不同富集方法所得总黄酮的含量

胡倩莲，张婕妤，2，梅格格，李竹君，李心怡，田雅，方振峰*（.江汉大学医学院药学系，武汉 430056；2.中南民族大学药学院，武汉 430074）

中药材半枝莲（Scutellaria barbataD.Don），别名狭叶韩信草、并头草，最先见于《药镜拾遗赋》[1]，为唇形科植物半枝莲的全草，常于夏季、秋季其茎叶茂盛时采挖。本品味辛、苦、性寒，归肺经[2]，具有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、抗肿瘤等功能[3]。半枝莲主要化学成分为生物碱、黄酮和多糖等[4]，其中黄酮类成分是半枝莲抗肿瘤作用的主要活性成分之一，因其抗肿瘤作用机制的多样化[5-8]，引起了科研工作者的极大兴趣。

目前关于半枝莲中总黄酮含量的测定已有一些文献报道，主要为以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定总黄酮含量[9-10]；或以黄芩苷为含量指标，用高效液相色谱（HPLC）法测样品中总黄酮含量[11-12]。文献报道[3，5-7]半枝莲总黄酮中黄芩苷、木犀草素、野黄芩苷、芹菜素等单体成分表现出良好的抗肿瘤活性，其中野黄芩苷的含量最高[13-14]，因此，研究半枝莲总黄酮富集方法时，需考虑同时将几种活性较好的黄酮单体成分的含量作为考察指标。文献中常见的总黄酮的富集方法主要集中于大孔吸附树脂法，但对于经典的总黄酮富集方法如碱提酸沉法，很少有报道，也很少有不同方法之间的对比。

本试验以抗肿瘤活性较好的单体成分木犀草素、野黄芩苷、芹菜素等含量之和为总黄酮含量指标，通过优化HPLC 条件，建立测定半枝莲黄酮成分的方法。通过比较3 种总黄酮富集方法（溶剂萃取法、碱提酸沉法和大孔树脂吸附法），探寻富集半枝莲具有抗肿瘤作用的黄酮成分的最佳方法，以期为半枝莲的进一步开发利用提供基础。

1 仪器与试药

ME104E 电子天平[精度：0.0001 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；AUX120D 分析天平（精度：0.01 mg）、UV-6780 紫外可见分光光度计[岛津国际贸易（上海）有限公司]；超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；真空旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（上海秋佐科学仪器有限公司）；XFB-200 中药粉碎机（湖南省吉首市中州机械厂）；安捷伦1220 高效液相色谱仪（安捷伦公司）；DHG-9030A 电热恒温鼓风干燥箱（上海圣科仪器设备有限公司）。

色谱乙腈、甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；水为自制的重蒸水；HE-802 型大孔吸附树脂（上海华震科技有限公司）；木犀草素（纯度≥99.6%，批号：64QB-BHW2）、野黄芩苷（纯度≥98%，批号：L9P5-TK35）、芹菜素（纯度≥99.2%，批号：O5NL-BRWD）对照品（成都曼斯特生物科技有限公司）。其他试药均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

半枝莲购自亳州中药材市场，产自河北省，经江汉大学医学院药学系张涛教授鉴定为黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbataD.Don 正品。

2 方法与结果

2.1 半枝莲总黄酮的提取

取适量半枝莲在烘箱内低温烘干，粉碎，过60 目筛，精密称取5.0 g 粉末，加入12 倍量药材重量的乙醇溶液（φ＝0.7），即180 mL 乙醇（φ＝0.7）水溶液，进行超声提取，超声功率250 W，超声温度为50℃[15]，提取3 次，每次1 h，过滤，合并提取液，在旋转蒸发仪上浓缩回收乙醇，至提取液没有醇味，得到半枝莲提取液30 mL。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 溶剂萃取法富集所得供试品溶液（供试品A 溶液） 依次采用等体积（即30 mL）的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液萃取“2.1”项下半枝莲提取液，萃取3 次，合并有机层，分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层。用盐酸镁粉反应鉴别各有机溶剂层是否含有黄酮，结果显示乙酸乙酯层、正丁醇层呈阳性，表明这两个有机层中含有黄酮类化合物。合并乙酸乙酯层与水饱和正丁醇层，回收溶剂，得浸膏0.6230 g。加入适量甲醇溶液，超声溶解，并用甲醇定容至25 mL。摇匀，用0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液0.5 mL，置于10 mL 量瓶，用甲醇定容，摇匀，即得供试品A 溶液。平行制备若干批，4℃保存，供测试用。

2.2.2 碱提酸沉法富集所得供试品溶液（供试品B 溶液） 取“2.1”项下半枝莲总黄酮提取液，加入饱和氢氧化钙水溶液以调节溶液pH 至8 ～9，然后加入浓盐酸调节溶液pH 至4 ～5[16]，静置后抽滤，所得固体水洗至中性，低温烘干，得浸膏0.1845 g。加入适量甲醇溶液，超声溶解，并用甲醇定容至25 mL。摇匀，用0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液0.5 mL，置于10 mL 量瓶，用甲醇定容，摇匀，即得供试品B 溶液。平行制备若干批，4℃保存，供测试用。

2.2.3 大孔吸附树脂法富集所得供试品溶液（供试品C 溶液） 取适量HE-802 型大孔吸附树脂，用95%乙醇溶液浸泡24 h，使大孔吸附树脂充分溶胀，倒出乙醇及漂浮物后，湿法装柱，用乙醇溶液（φ＝0.95）洗涤树脂，直至层析柱流出液加入蒸馏水（1∶1，V/V）后不呈白色浑浊状，再用去离子水洗至流出液澄清并且没有醇味后备用，计算柱床体积为80 mL；将“2.1”项下半枝莲总黄酮提取液沿壁缓缓加入层析柱中，吸附1 h 后，用2 BV（160 mL）水洗2 次，流速为2 mL·min－1，待水滴完后，再使用2 BV（160 mL）乙醇（φ＝0.2）溶液洗脱杂质，流速为2 mL·min－1，用2 BV（160 mL）的乙醇（φ＝0.5）溶液洗脱总黄酮[11，17]，流速为2 mL·min－1，每流份为0.5 BV，同时，对所得流份用盐酸镁粉反应进行鉴别，合并阳性反应流份，回收溶剂，得浸膏0.2336 g。浸膏加入适量甲醇溶液，超声溶解，并用甲醇定容至25 mL。摇匀，用0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液0.5 mL，置于10 mL 量瓶，用甲醇定容，摇匀，即得供试品C 溶液。平行制备若干批，4℃保存，供测试用。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取木犀草素、野黄芩苷、芹菜素对照品适量，置于量瓶中，用甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，配制得到含野黄芩苷272.02 μg·mL－1、木犀草素261.34 μg·mL－1、芹菜素248.03 μg·mL－1的混合对照品溶液，于4℃下保存备用。

2.4 色谱条件

色谱柱：GALAK EF-C18M 色谱柱；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～5 min，20% A；5 ～20 min，20%～28%A；20 ～30 min，28 ～30% A；30 ～35 min，30% ～35%A；35 ～50 min，35% ～60% A；50 ～51 min，60%～90% A；51 ～60 min，90% A）；流速：0.8 mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：335 nm；进样量：20 μL。

2.5 系统适用性试验及专属性试验

分别精密量取“2.2”供试品溶液和“2.3”项下混合对照品溶液适量，按“2.4”项下方法进行含量测定，记录其色谱图，见图1。由图1可知，野黄芩苷保留时间为13.580 min，木犀草素保留时间为31.274 min，芹菜素保留时间为40.630 min，其分离度均大于1.5，表明在此色谱条件下3 种黄酮类化合物能有效分离，其他成分无干扰。

图1 4 种溶液的HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of 4 solution

2.6 线性关系考察

精密量取“2.3”项下混合对照品溶液用甲醇稀释成一系列浓度梯度的混合对照品溶液。采用“2.4”项下方法测定，记录峰面积。分别以野黄芩苷、木犀草素、芹菜素的峰面积为Y轴，质量浓度为X（μg·mL－1）轴建立回归方程，结果见表1。结果表明，野黄芩苷、木犀草素、芹菜素在各自质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系。

表1 线性回归方程及相关系数Tab 1 Regression equation and related coefficient

2.7 精密度试验

精密吸取“2.6”项下混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6 针，测得野黄芩苷、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD值分别为0.32%、0.18%、0.21%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取“2.2”项下供试品溶液6 份，按“2.4”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，测得野黄芩苷、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD值分别为1.5%、1.1%、1.4%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取“2.2”项下供试品溶液，在室温下静置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.4”项下色谱条件进行测定，测得野黄芩苷、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD值分别为1.7%、1.3%、1.6%，表明样品中3 种黄酮单体成分在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收试验

精密称取已知野黄芩苷、木犀草素、芹菜素含量的同一半枝莲粉末27 份，每份2.5 g，精密加入相当于样品含量80%、100%和120%（按3 种富集总黄酮方法所得各自的成分含量结果计算）的野黄芩苷、木犀草素、芹菜素对照品，按“2.1”项下方法提取，按“2.2”项下各富集方法制得供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算加样回收率。3 种提取方法所得野黄芩苷、木犀草素、芹菜素平均回收率均＞100.0%，RSD均＜1.0%（n＝3）。

2.11 不同富集方法所得样品的含量测定

取“2.2”项下3 种样品各约5.0 g，平行3 份，按“2.4”项下色谱条件测定，计算样品中野黄芩苷、木犀草素、芹菜素的含量及三者之和的含量，结果见表2。采用溶剂萃取法得到总黄酮浸膏0.6203 g（n＝3），产率为12.41%（n＝3）；采用碱提酸沉法得到总黄酮浸膏0.1845 g（n＝3），产率为3.69%（n＝3）；采用大孔树脂吸附法得到总黄酮浸膏0.1869 g（n＝3），产率为3.74%（n＝3）。其中，溶剂萃取法富集得到的总黄酮浸膏量最大，碱提酸沉法和大孔树脂法富集的总黄酮浸膏差别不大。从表2中可知，碱提酸沉法所富集的总黄酮含量（以野黄芩苷、木犀草素、芹菜素的含量之和计）最高，达到92.6773 mg。

表2 3 种不同方法所富集总黄酮的含量测定结果(n ＝3，mg·g－1)Tab 2 Content determination of total flavonoids enriched by 3 different methods (n ＝3，mg·g－1)

利用SPSS 22.0 软件对3 种不同富集方法所得总黄酮中野黄芩苷、木犀草素、芹菜素的含量分别进行单因素ANOVO 统计分析，同一成分在不同组间的平均值差异具有统计学意义（P＜0.001），表明不同的富集方法得到的黄酮成分的含量存在非常显著的差异。其中碱提酸沉法富集所得总黄酮浸膏中野黄芩苷、木犀草素、芹菜素含量均是最高的，总黄酮含量也最高。

3 讨论

本试验采用超声提取法提取半枝莲，采用不同方法（溶剂萃取法、碱提酸沉法、大孔树脂吸附法）富集半枝莲总黄酮。利用高效液相色谱法，以抗肿瘤活性较好的单体成分木犀草素、野黄芩苷、芹菜素等含量之和为总黄酮含量指标，考察了3 种富集抗肿瘤活性黄酮成分的方法，结果最好的方法为碱提酸沉法。

本试验分别考察了GALAK EF-C18M（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Zorbax C18（4.6 mm× 250mm，5 μm）和YMC-Pack C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱对样品中成分分离的影响，结果发现GALAK EF-C18M（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱对木犀草素、野黄芩苷、芹菜素分离效果最好，因此选用其作为本试验的色谱柱。

分别考察了0.5、0.8、1.0 和1.2 mL·min－14 种不同流速对样品中成分分离的影响，结果发现0.8 mL·min－1时，主峰的分离度好且分析时间较合理，因此本试验选用0.8 mL·min－1作为流速。

在本试验中，大孔吸附树脂法富集所得总黄酮中芹菜素的含量较低，可能和芹菜素在半枝莲中含量本来不高，且在3 个化合物中其极性最小，导致洗脱不彻底以及盐酸镁粉检测时溶液中含量低，检测未显色，未计算这部分含量有一定关系。