腹水草水提液通过调控NF—κB信号通路抗乙醇对GES—1细胞的损伤＊

（浙江中医药大学生命科学学院，浙江杭州 310053）

胃溃疡的发生与胃粘膜上皮细胞的损伤有着密切关系。当胃粘膜受到严重损伤时，胃粘膜上皮细胞的结构和功能被破坏，导致细胞增殖和死亡的失衡，进而导致胃溃疡、胃炎等疾病的发生[1]。腹水草（Veronicastrum axillare）为玄参科腹水草属植物，具有逐水消肿，清热解毒，治臌胀、小便不利、大便不通等功效[2]。前期研究表明，其水提液显著降低无水乙醇对大鼠胃粘膜的损伤[3]。本文采用体外培养人胃上皮细胞GES-1细胞制备乙醇损伤细胞模型，研究腹水草水提液对GES-1细胞NF-κB信号通路的调控作用，为明确腹水草水提液抗胃溃疡的分子机制提供实验依据。

1.材料与方法

1.1 材料

腹水草水提液和雷尼替丁混悬液的制备方法见文献[3]。GES-1细胞株购自南京市科佰生物科技有限公司；DMEM高糖培养基购自HyClone公司；TNF-α、TNFR-1、IKBα、IKKβ和NF-κB ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；Trizol试剂、PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 GES-1细胞的分组及造模

GES-1细胞的培养方法见文献[4]。取对数生长期的细胞，以1×106个/ml接种于6孔板，每孔2ml，培养24h后，弃原培养基，将细胞分为正常组、模型组、雷尼替丁组（45μg/ml）、腹水草高（80μg/ml）、中（40μg/ml）、低（20μg/ml）剂量组，每组6个复孔。正常组、模型组加入2ml培养基。雷尼替丁组、腹水草高、中、低剂量组分别加入含雷尼替丁、腹水草各浓度的培养基2ml。培养24h后弃培养基，正常组加2ml培养基，其余各组每孔加入2ml含5%乙醇的培养基，培养4h后，上清液转移到EP管中，3000r/min，离心10min，上清液用于检测TNF-α蛋白的表达水平。细胞板中的细胞和EP管中的沉淀用于细胞总蛋白和总RNA的提取。

1.2.2 ELISA检测NF-κB信号通路关键因子蛋白的表达

将各组细胞收集细胞于EP管中，1000r/min离心5min，去上清。沉淀中加入150μL含有蛋白酶抑制剂（PMSF）的RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min离心10min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。双抗体夹心ELISA检测GES-1细胞上清液中TNF-α和胞内TNFR-1、IκBα、IKKβ及NF-κB蛋白的表达量。

1.2.3 荧光定量RT-PCR检测NF-κB信号通路关键因子mRNA的表达

采用Trizol试剂提取总RNA，取0.5μg RNA采用Prime ScriptTMRT Master Mix试剂盒进行逆转录，逆转录产物采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit扩增目的基因cDNA片段，PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃5s，60℃30s，共40个循环，根据2-ΔΔCt法，以β-actin为内参基因分析 mRNA相对表达量。引物序列及产物大小见文献[4]。

1.2.4 统计学处理

所有数据以均数±标准差（±S）表示，单因素方差分析组间差异，LSD法两两比较，p＜0.05为有统计学意义。

2.结果

由图1可知，与正常组相比，模型组中TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB蛋白和mRNA表达量显著升高（p＜0.01），雷尼替丁组及腹水草低、中剂量组显著上调TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB mRNA的表达（p＜0.05或p＜0.01），腹水草水提液中、高浓度组IκBα蛋白表达量升高（p＜0.05或p＜0.01）；与模型组相比，雷尼替丁及腹水草各剂量均显著下调 TNF-α、TNFR-1、IκBα、IKKβ、NF-κB蛋白和mRNA表达水平（p＜0.05或p＜0.01），且呈剂量依赖性。

图1 腹水草水提液对GES-1细胞NF-κB信号通路关键因子表达的影响

3.讨论

酒精性胃粘膜损伤性疾病是指由于大量饮酒引起胃粘膜损伤而诱发的疾病，如胃溃疡、胃出血等[1]。乙醇可通过脱水作用（凝固组织蛋白）、中性粒细胞浸润、氧自由基、前列腺素、胃粘膜屏障、胃酸分泌、粘膜微循环等途径损伤胃组织[4]，还可诱导细胞发生炎症反应和细胞凋亡[1]。炎症反应和炎症细胞浸润胃粘膜后，释放出的炎性细胞因子能加重胃溃疡的发生，过度使用乙醇可激活内在免疫机制，使得促炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β水平升高[5]。本研究结果显示，与模型组相比，腹水草水提液各组GES-1细胞中 TNF-α、TNFR-1、NF-κB、IκBα、IKKβ 蛋白和mRNA的表达量均显著降低，表明腹水草水提液可通过转录和翻译水平调控NF-κB信号通路来抑制乙醇诱导的炎症反应，从而保护GES-1细胞。这一结果与项目组前期用腹水草含药血清进行体外药效实验的结果一致[4]。

在本研究中，我们分别检测了细胞培养上清中TNF-α的表达水平和细胞中TNFR-1、NF-κB、IκBα、IKKβ的表达水平，这主要是由于TNF-α分泌到细胞外，而其余蛋白为胞内蛋白的原因。此外，当用乙醇处理细胞后，大量细胞出现漂浮现象，我们在收集细胞的时候通过离心回收漂浮细胞以减少实验误差，起到了良好的效果。这为腹水草的临床应用提供相应的理论与实验依据。