棠梨果实中绿原酸提取工艺的优化及抗氧化作用

广东省科学院，广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学危害应急检测技术重点实验室（广州 510070）

棠梨（Pyrus calleryanaDecne）别名杜梨、海棠梨、野梨子，是蔷薇科梨属植物[1]，分布于我国云南、四川、贵州和甘肃等省，长在海拔1 000～1 500 m的高山喜光林中或灌木草原上。我国对于棠梨的应用具有悠久的历史，棠梨味酸、甘、涩、性寒，可全株入药，其果实具有润肠通便、消肿止痛、敛肺涩肠以及止咳止痢之效。其根和叶入药可润肺止咳、清热解毒，主要用于治疗干燥咳嗽、急性眼结膜炎等症[2-4]，在古代多被用于疏肝和胃、缓急止泻。棠梨具有良好的药用和保健功能，在食品、保健品和医药行业有着良好的应用前景[5-6]。

目前对于棠梨的相关研究较少，其果实具有一定的药用效果，棠梨果实中绿原酸含量较高，具有一定的开发价值。绿原酸由咖啡酸和奎尼酸缩合而成，具有一定的抗氧化[7]、抗癌[8]、降脂和降血压[9-10]等作用。此次试验采用甲醇进行提取，在单因素的基础上，利用响应面优化法，对棠梨果实中绿原酸进行提取工艺的优化。为棠梨果实的开发与利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棠梨果实（产地江西，样品干燥至恒质量，备用）；绿原酸标准品、芦丁标准品、抗坏血酸（中国食品药品检定研究院）；1,1-2苯基-2-三硝基苯肼、无水甲醇（AR，广州试剂厂）。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；Sartorius电子天平（BSA224S，广州市深华实验仪器设备有限公司）；摇摆式中药粉碎机（上海顶帅电气公司）；KQ2200B超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科贸有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 绿原酸的提取

精密称取1.0 g粉碎均匀的棠梨果实于离心管中，加入一定体积的甲醇溶液，置于超声波清洗仪中进行提取，设定超声时间与温度。待提取液冷却后真空抽滤，将滤液定容至100 mL，将其过0.22 μm针孔过滤器，待测。

1.3.2 绿原酸标准曲线的测定

吸取106.5 μg/mL绿原酸标准溶液于100 mL比色管中，配制成质量浓度依次为0.0，4.26，8.52，12.78，17.04，21.30和25.56 μg/mL绿原酸标准品待测溶液。以零管为空白，在波长328 nm处测定标准溶液的吸光度。以绿原酸标准溶液的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线，得到回归方程A=0.051 8C+0.003 000，相关系数R=0.999 9。棠梨果实样品中绿原酸含量根据标准曲线回归方程算得，提取率按式（1）计算。

式中：C为样品中绿原酸含量，μg/mL；V为定容体积，mL；W为称样量，g。

1.3.3 单因素试验设计

精密称取1.0 g粉碎后的棠梨果实，以绿原酸的提取率为指标，研究甲醇体积分数（40%，50%，60%，70%和80%）、提取温度（30，40，50，60和70 ℃）、提取时间（10，20，30，40和50 min）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）对棠梨果实中绿原酸提取率的影响。

1.3.4 因素水平设计

以单因素试验结果为基础，选择对棠梨果实中绿原酸提取率有影响的4个因素，采用响应面优化法中的Box-Behnken设计进行优化试验。以甲醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和料液比（D）为自变量，绿原酸的提取率为响应值进行试验设计，因素水平设计如表1所示。

表1 响应面分析因素水平

1.3.5 棠梨果实中绿原酸、抗坏血酸、芦丁抗氧化能力的测定[11-12]

准确称取23.8 mg DPPH试剂，用70%的甲醇溶液配制成6.0×10-5mol/L DPPH溶液，作为母液于冰箱冷藏备用。吸取10 mL DPPH母液，用70%甲醇定容至100 mL，作为DPPH自由基测定的反应试剂。取2 mL不同浓度样品液，与2 mL DPPH溶液混合，避光反应30 min，在517 nm波长下测定吸光度A1，用2 mL 70%甲醇代替样品液测得吸光度A0，抗坏血酸作为阳性对照。平行操作重复3次，清除率按式（2）计算。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 甲醇体积分数和提取温度对含量的影响

由图1（a）可知，随着甲醇体积分数增加，绿原酸提取率逐渐增大，当体积分数为70%时绿原酸提取率达到最大，随后降低。这是由于绿原酸的分子结构中含多个羟基和羧基的大极性基团。在一般情况下，甲醇体积分数越低，溶解性越差，绿原酸提取率越少。随着溶剂体积分数的增高，提取率逐渐增大，但溶剂体积分数过高，可以使一些醇溶性杂质、色素等溶出量增大，导致绿原酸提取效果不佳，所以才会出现先升高后降低的现象。因此，棠梨果实绿原酸提取较适宜的甲醇体积分数为70%。由图1（b）可知，随着温度的升高，绿原酸的提取率逐渐增大，当提取温度为60 ℃时提取率达到最大，继续升温则会有所降低。因为温度过高会导致绿原酸中的酚羟基和羧基被破坏，形成新的物质，导致提取率降低。

图1 甲醇体积分数与提取温度对绿原酸提取率的影响

2.1.2 提取时间和料液比对绿原酸提取率的影响

由图2（a）可知，棠梨果实中绿原酸的提取率随着提取时间的延长呈现先上升后下降的现象，提取时间30 min时绿原酸含量最高。可能过长的提取时间使部分绿原酸结构被破坏，从而导致绿原酸含量降低。因此，选择30 min为提取时间。由图2（b）可知，不同料液比对绿原酸提取率影响相对较大。随着料液比的增大，绿原酸含量逐渐增大，当料液比为1∶30（g/mL）时，绿原酸提取率达到最大，而后达到一个稳定作用。因此，棠梨果实绿原酸提取率较适宜的料液比为1∶30（g/mL）。

图2 提取时间与料液比对绿原酸提取率的影响

2.2 响应面优化提取条件

2.2.1 响应面试验结果及分析

根据表1中响应面试验方案，设计试验及试验结果见表2，方差分析见表3。

根据Design-Expert 7.0软件的分析结果可知，该模型p值小于0.000 1，表明模型拟合成功。对绿原酸的提取率采用二次多项式模型分别进行拟合，其方程为

Y提取率=1.26-0.013A-0.026B+0.059C-0.078D+2.750×10-3AB-7.500×10-4AC-0.038AD+1.000×10-3BC+0.036BD+0.044CD-0.15A2-0.13B2-0.041C2-0.084D2（R2=0.990 7）

拟合方程相关性R＞0.9，其拟合度良好，可用于棠梨果实中绿原酸提取率的优化。

2.2.2 响应面交互作用分析

采用Design-Expert 7.0软件对所得试验进行响应曲面分析，得出两两因素之间对棠梨果实中绿原酸提取率的影响，结果如图3所示。

由图3和表3中各因素p值可知，提取温度、提取时间和料液比影响显著。通过Design-Expert 7.0软件的分析，最优提取条件为甲醇体积分数70.0%，提取温度58.5 ℃，提取时间45.2 min，料液比1∶26.4（g/mL）；在该条件下，绿原酸的提取率为1.294%。为方便实际操作，修正最优条件为甲醇体积分数70%，提取温度58 ℃，提取时间45 min，料液比1∶26（g/mL）。

表2 试验方案及结果

表3 棠梨果实中绿原酸提取率的回归方程方差分析

图3 两两因素交互对棠梨果实中绿原酸提取率提取量的影响

2.2.3 最佳条件验证

由图4和表4可知，棠梨果实中绿原酸、VC、芦丁均具有较强的DPPH自由基清除能力，且清除能力随着抗氧化样品溶液浓度的增大而增强。

按2.2.2的最优试验条件，进行6次平行验证试验，测得绿原酸的提取率平均值为1.278%，与预测值接近，且RSD为1.110%，表明响应面分析所得的理论最佳提取条件准确可靠。

表4 VC、绿原酸和芦丁回归方程与IC50值

图4 VC、绿原酸和芦丁对DPPH自由基的清除作用

2.3 金银花绿原酸提取物的抗氧化能力评价

通过比较三者的半数清除率IC50可知，棠梨果实绿原酸抗氧化能力略强于VC，芦丁相比绿原酸及VC，抗氧化能力较差。

3 结论

以棠梨果实中绿原酸的提取率为指标，探讨了不同甲醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度对绿原酸提取率的影响。在单因素试验的基础上，以甲醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度为影响因素，应用Box-Behnken响应面优化试验设计，以绿原酸的回收率为响应值，进行响应面分析，确定了最佳试验条件：甲醇体积分数70%，提取温度58 ℃，提取时间45 min，料液比1∶26（g/mL）。该条件下绿原酸的提取率达到最大。试验还考察了棠梨果实中绿原酸的抗氧化活性，其DPPH自由基的半数清除率为0.935 μg/mL，具有较好的抗氧化活性。因此，此次研究结果对棠梨的综合开发利用具有一定的参考价值。