正交试验法优化玛咖多糖含量的测试方法

杨秀峰，魏金超，高玉梅，陈芮*

1.云南师范大学化学化工学院（昆明 650500）；2.中国科学院化学研究所（北京 100190）

玛咖（学名为Lepidium meyeniiWalp，西班牙语又称Maca）是一种原产于南美洲的十字花科植物，现已成功引种于中国云南、新疆、西藏等地区[1]。玛咖作为一种纯天然食品，富含高单位营养素，具有滋补强身的功效。Dini等[2]曾报道玛咖干根中含有的功效成分为多糖、生物碱、芥子油苷及多酚类物质等。研究发现：玛咖中还含有两种次生代谢物——玛咖酰胺和玛咖烯，它们是玛咖中特有的活性成分[3-4]。此外，玛咖还具有抗疲劳[5]、增强细胞免疫功能[6]、抗氧化及提高生育能力等功效[7]。

多糖是由超过10个单糖的糖苷键结合成糖链而形成的高分子碳水化合物，是一种广泛存在于高等植物、动物细胞膜、微生物的细胞壁中的天然大分子物质，也是构成生命的四大基本物质之一[8]。玛咖多糖作为玛咖中的有效成分之一，具有抗肿瘤、提高生育能力、降血糖等作用[9]，此外还具有重要的生物活性，如较强的自由基清除能力[10-12]，对酒精诱导的细胞损伤及环磷酰胺诱导的小鼠具有保护作用[13-14]；抗疲劳活性[15]及增强免疫活性等[16-17]。玛咖多糖因为其优异的生物活性已受到众多学者的青睐。

随着科学技术的发展，多糖的提取技术越来越多样化，从最传统的溶剂萃取法发展到酶法，随后引入超声辅助法和微波辅助法[18-20]，再到超临界萃取技术的应用[21]。对于玛咖多糖，传统的提取方法为热水、碱水和酸水浸提法等，研究报道超声辅助提取和三相萃取法等提取手段也被应用于玛咖多糖的提取[22-24]。正交试验设计法能够实现以最少的试验次数达到与大量全面试验等效的结果，因此被认为是一种高效、快速、经济的多因素多水平的试验设计方法。拟用水提法来测定玛咖中多糖的含量。在单因素研究的基础上通过正交试验设计法对玛咖中多糖的提取过程进行优化。

1 试剂与仪器

1.1 材料与试剂

试验所用的试剂均为分析纯；丽江玛咖，云南省昆明市丰熙茶行提供。

1.2 仪器与设备

UV-8000s型紫外-可见分光光度计，上海菁海仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 玛咖多糖的提取过程

玛咖干粉→水浴提取→离心分离，收集上清液→热水洗涤沉淀，收集上清液→合并上清液→多糖含量的计算

2.2 葡萄糖储备液的配制

精确称取0.010 0 g葡萄糖，用水溶解后定容至100 mL，配制成0.100 mg/mL的葡萄糖储备液，于4 ℃保存备用。

2.3 玛咖干粉中多糖含量的计算

多糖含量采用苯酚-硫酸法[25]测定，结合葡萄糖溶液工作曲线按照（1）计算：

式中：W为试样的质量，mg；C为葡萄糖的质量浓度，mg/mL；D为稀释因子；F为换算因子。

3 结果与分析

3.1 最佳波长的选择

吸取1 mL葡萄糖储备液，补充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚，迅速加入5 mL浓硫酸，混匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，冷水中冷却。以蒸馏水为空白对照，于300～600 nm测定吸光度。该溶液在此范围内的最大吸收波长即为测定样品的最佳波长。由图1可知，样品在300～600 nm处出现了2个吸收峰，对应的波长分别为325和490 nm。490 nm对应的吸收峰的强度明显地强于325 nm的吸收峰，故试验选择490 nm为测定的最佳波长。这一试验结果与王金全[26]在玛咖多糖提取工艺的研究试验中选择的最佳波长一致。

图1 0.100 mg/mL葡萄糖标准溶液的紫外-可见吸收光谱图

3.2 仪器精密度试验

吸取6份葡萄糖储备液于10 mL比色管中，利用苯酚-硫酸法测量吸光度检测所用紫外-可见吸收光谱仪的精密度。如表1所示，平行试验6次，测得葡萄糖溶液在490 nm的吸光度无明显变化，δRSD为2.04%。这一结果表明试验所用仪器精密度良好。

表1 仪器精密度试验结果（n=6）

3.3 工作曲线的绘制

分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL葡萄糖储备液，配制过程同最佳波长的选择所用溶液的配制过程。测定490 nm的吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标绘制工作曲线。如图2所示，在0.02～0.06 mg/mL质量浓度范围内，线性回归方程为A=14.616 7C+0.046 21，相关系数R2=0.999 7。结果表明：在该质量浓度范围内，葡萄糖的质量浓度与吸光度呈现良好的性线关系。

图2 葡萄糖标准溶液的工作曲线

3.4 换算因子的测定

称取0.010 0 g干燥至恒质量的玛咖多糖，溶解并定容至100 mL。吸取2 mL于10 mL比色管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，加入5 mL浓硫酸，煮沸15 min后于冷水中冷却，在490 nm下测定吸光度，按照（2）计算换算因子。

式中：F为换算因子；W为试样的质量，mg；C为葡萄糖标准溶液的质量浓度，mg/mL；D为稀释因子。

3.5 玛咖多糖提取工艺的评价

试验首先以料液比、提取温度、提取时间为单因素，分别研究其对玛咖多糖含量的影响。在单因素试验的基础上，选取温度、料液比、时间进行三因素三水平正交试验以确定测定过程中所需玛咖多糖提取的最佳条件。正交设计试验因素水平如表2所示。

3.5.1 单因素试验

3.5.1.1 料液比对多糖含量的影响

称取1 g玛咖干粉，按照料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），在70 ℃下，提取1 h，离心分离收集上清液，沉淀用热水洗涤一次，离心收集上清液，合并两次上清液，并定容至250 mL。移取0.5 mL此溶液定容至10 mL。从中取1 mL溶液于10 mL比色管中，并补充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚溶液，加入5 mL浓硫酸，煮沸15 min后冷却，在490 nm测定吸光度。结合式（1）和（2）计算多糖含量。由图3可知：玛咖多糖含量先随着料液比的增加而增加，当料液比增加到1∶30（g/mL）时，含量最大；随后随着料液比的增加，含量又逐渐减小。这种现象可归为由于提取溶剂过少，提取不充分导致多糖含量较低；但溶剂过多将会使样品浓度降低，不利于多糖提取，并且过多的溶剂会带来后续溶剂回收成本过高的问题。因此，玛咖多糖提取的最佳料液比应控制在1∶30（g/mL）左右。

表2 正交设计试验因素水平表

图3 料液比对玛咖多糖含量的影响

3.5.1.2 提取温度对多糖含量的影响

称取1 g玛咖干粉，在40，50，60，70和80 ℃，料液比1∶30（g/mL）条件下，提取1 h。后续操作同3.5.1.1。玛咖多糖的含量与温度的关系如图4所示。玛咖多糖含量随着温度的升高，先上升后下降，在50 ℃时达到最大。这是因为温度越高，多糖越容易进入水相从而使玛咖多糖的含量升高；当温度超过某一值后，不但会引起多糖与其他物质之间的有机反应，还会破坏多糖的结构，使多糖含量下降。故测定玛咖多糖含量时，提取玛咖多糖的最佳温度为50 ℃。这一结论与王金全[26]通过水提法优化玛咖多糖工艺试验中采用的温度一致。

3.5.1.3 提取时间对多糖含量的影响

称取1 g玛咖干粉，料液比1∶30（g/mL），在50 ℃分别提取0.5，1，1.5，2和2.5 h。其余操作按3.5.1.1项进行，计算多糖的含量。如图5所示：玛咖多糖含量会随着提取时间的延长先增加后减小，当时间延长到1 h时，含量最大。这是因为在一定的料液比和提取时间下，体系会达到提取平衡，含量将会在平衡值附近波动，而不再增加。因此，测定玛咖多糖含量时，玛咖多糖提取的最佳时间为1 h。

图4 温度对玛咖多糖含量的影响

图5 时间对玛咖多糖含量的影响

3.5.2 正交设计试验

正交设计试验及极差分析如表3所示。对玛咖多糖含量影响最大的因素是温度，时间次之，最小的是料液比，即影响程度依次为提取温度（A）＞提取时间（C）＞料液比（B）。测定玛咖多糖含量时，提取玛咖多糖的最佳工艺条件组合为A2B3C2，也就是温度50 ℃，料液比为1∶40（g/mL），提取时间1 h。

表3 正交设计试验结果

称取1 g的玛咖干粉，在50 ℃、料液比1∶40（g/mL）的条件下浸提1 h，后续操作同3.5.1.1。此时，测得玛咖多糖含量为18.97%，高于表中最大含量。在此条件下得到的玛咖多糖的含量与徐娟等[27]利用超声辅助法在最佳工艺下提取黑玛咖多糖的含量9.03%相比，有显著的提高。故该方法可认为是提取玛咖多糖的有效方法。

3.6 稳定性试验

称取1 g玛咖干粉，在最佳条件下提取、离心分离收集上清液，沉淀用热水洗涤，离心收集上清液，合并两次上清液，并定容至250 mL。吸取1 mL于10 mL比色管中，补充水分至2 mL，加入1 mL 6%的苯酚，迅速加入5 mL浓硫酸，混匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，冷水中冷却。以蒸馏水为空白对照，分别于0，2，6，18和24 h在490 nm测量吸光度，结果见表4。在24 h内，试验样品溶液的吸光度无明显变化，δRSD为2.53%，说明采用该法得到的玛咖多糖具有良好的稳定性。

表4 稳定性试验结果（n=3）

3.7 加标回收试验

称取1 g玛咖粉末，操作同3.6。分别精密吸取1.00 mL此溶液于4支10 mL比色管中，一支加入1 mL蒸馏水，其余3支分别加入100 μL 0.10，0.050和0.025 mg/mL葡萄糖标准溶液，并补充水分至2 mL后，按3.6项方法操作，平行试验3次，按照式（3）计算加标回收率。

如表5所示，该方法回收率在104.00%～118.60%之间，平均回收率为109.67%，δRSD为7.14%，说明该测定方法准确率高，可用于玛咖中多糖含量的测定。

表5 加标回收率试验结果（n=3）

4 结论

试验用苯酚−硫酸法测定玛咖多糖的含量。采用水提法，以料液比、提取温度、提取时间为单因素，分别研究其对玛咖多糖含量的影响。在单因素试验的基础上，进行三因素三水平正交设计试验进一步得到了测定玛咖多糖含量时提取的最佳条件。结果表明：这3个因素对玛咖多糖含量影响大小为温度（A）＞时间（C）＞料液比（B）；料液比1∶40（g/mL），在50 ℃提取1 h，玛咖多糖的含量最高，可达18.97%。试验证明：所用的紫外-可见分光光度计精密度良好，该法得到的玛咖多糖的稳定性好，回收结果也令人满意。鉴于水提取玛咖多糖具有多糖含量高、省时、技术简单等优点，因此认为这种方法也可以作为提取玛咖多糖的有效方法。