环糊精葡萄糖基转移酶的固定化研究进展

郭姣梅，郝建华，李晓涵，王伟，孙晶晶，宋凯

1.农业农村部极地渔业开发重点实验室，青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所（青岛 266071）；2.上海海洋大学食品学院（上海 201306）

环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）属于α-淀粉酶第13号家族的重要成员，可催化淀粉转化为环糊精。环糊精（CD）是由6个（α-CD），7个（β-CD）或8个（γ-CD）D-吡喃葡萄糖单体以α-1,4-糖苷键连接而成的环状低聚糖。它是一种筒形结构的分子，具有内部疏水、外部亲水的结构[1-2]，正是基于这种特殊结构，使得环糊精及其衍生物在食品、医药、生物技术、化妆品、化学工业、膳食纤维及其他方面有很大应用前景[3-8]。生产环糊精需要大量具有高特异活性的CGTase。因此，有关CGTase的研究越来越多[9]，但由于游离CGTase在工业应用中不可重复使用，稳定性差等不利因素，使得其应用受到很大限制，故需要将酶进行固定化解决这个问题。将CGTase固定化后，提高其稳定性，使其能够反复使用，同时便于运输和储存，有利于自动化生产。国内在固定化酶方面的研究较为常见，但对CGTase的固定化研究报道较少，因此对CGTase的固定化研究进展进行阐述。

1 CGTase固定化方法的国内外研究现状

固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。1971年首届酶工程会议上确认“固定化酶”的术语。固定化酶即酶的定位和限制，是指将游离酶与载体结合，使游离酶被固定在一个有限空间内，不能自由移动，但仍处于溶解状态[10]。酶被固定化后，易于从产物和底物中分离，能够有效回收和再利用。相比于游离酶，固定化酶的热稳定性和操作稳定性均增强[11]。

酶的传统固定化技术如图1所示，主要分为吸附法、包埋法、载体交联法、共价结合法等。1977年，Nakamura等[12]首次报道CGTase的固定化研究，此后固定化CGTase的研究越来越多。

图1 酶的固定化技术分类[13]

1.1 吸附法

吸附法作为最简便的方法，它主要是依靠酶蛋白和各载体之间的弱作用力，如氢键、范德华力、疏水作用力等，使酶被吸附在载体材料表面或固定在介孔材料的孔隙中[13]。吸附法分为物理吸附法和离子吸附法，其中物理吸附法是常用的一种方法。在这种固定化方法中，常用的载体是阳离子和阴离子交换树脂、活性炭、硅胶、氧化铝、陶瓷等。

对CGTase的固定化而言，吸附法是早期研究较多的一种固定化方法，Suhaimi等[14]采用吸附法将CGTase固定在聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纤维膜上。研究固定化CGTase的稳定性和可重复使用性。结果表明，固定化CGTase显示出良好的物理和化学特性，在70 ℃下仍能保持50%初始活性且其稳定性也得到改善，有利于在工业中应用。

1.2 共价结合法

共价结合法是以载体材料上的基团和酶蛋白中的相应基团（如羧基、氨基、醛基等）形成共价键，使酶被固定在载体上，因此载体材料是影响共价键固定化酶性能的关键因素，共价结合法是研究最多，也是最成熟的一种固定化方法。

共价结合法中固定化酶载体的选择越来越广泛。Sulaiman等[15]用漂白的洋麻超细纤维来固定化CGTase，将CGTase通过间隔臂-配体之间的相互作用成功地固定在纤维素纳米纤维（CNF）上。研究固定化CGTase的储存稳定性、热稳定性和可重复使用性。结果表明，固定化CGTase在CNF上的蛋白结合产率超过62%，并获得超过45%的残留活性。固定化CGTase在重复使用10次时最多可保留50%～60%的CGTase活性。研究表明通过共价结合可将CGTase成功固定在CNF上。Schoffer等[16]用2种不同方法固定化CGTase，分别是使用戊二醛活化的氨基化二氧化硅载体（Si-NH-G-CGTase）和巯基化二氧化硅载体（Si-SH-CGTase）。固定化后，Si-NH-G-CGTase具有较高的总生产率，能保持100%初始活性至少200 h，而Si-SH-CGTase只能保持初始活性的40%。

探究采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子，并依次以正硅酸四乙酯（TEOS）为硅源、以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）为硅烷偶联剂对磁性纳米粒子进行表面修饰，最终得到氨基硅烷化的磁性纳米粒子（Fe3O4@SiO2-NH2）。利用该磁性材料固定化CGTase的固定化酶热稳定性、对酸碱的耐受性和储存稳定性明显优于游离酶。

1.3 包埋法

包埋法是指利用凝胶网格和高分子半透膜材料，使酶分子被包埋于特定的结构之中[17]。包埋法分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法[18]。20世纪80年代，有研究首次将CGTase包埋在藻酸纤维中。

常用的包埋物质是海藻酸盐。郭燕等[19]研究CGTase被海藻酸钠包埋固定的最优条件。研究表明，固定化酶的pH稳定性及热稳定性要优于游离酶。连续使用7次后仍有75%的酶活，有良好的操作稳定性。Rakmai等[20]将CGTase与含有3 g/100 mL海藻酸钠和3 g/100 mL明胶的糊状物混合，可获得固定化产率87.5%的包埋酶。在50 ℃温育12 h后，固定化CGTase保留超过50%初始活性，而游离CGTase仅保留30%左右。

1.4 交联法

交联法是利用双功能或多功能团的交联剂，与酶分子中的氨基（—NH2）、羧基（—COOH）发生化学连接，使酶分子之间形成一种相互关联的复杂结构，其不溶于水，易于从溶液中分离，因此得到固定化酶[21]。交联法中使用较多的交联剂是具有双功能团醛基的戊二醛。

1.4.1 载体交联法

杨红艺等[22]以DEAE纤维素、硅胶、壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，对α-CGTase进行固定化最佳条件和固定化酶性质研究。结果表明，固定化酶可以连续使用4次以上，且在4 ℃ CaCl2溶液中保存18 d，有80%以上活力。校秋燕等[23]以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂共价交联固定CGTase。研究表明，在最佳固定化条件下，固定化CGTase的酶活回收率达94.5%，比活最高为39.7 U/g。这使固定化CGTase催化甜菊糖的转葡萄糖基反应成为可能。

1.4.2 无载体交联法

载体对CGTase进行固定化过程复杂，成本较高。交联酶聚集体（CLES）是一种无载体固定化技术，通过加入戊二醛等双功能交联剂，将聚集在一起的酶分子相互交联，从而得到固定化酶。Zhang等[24]将CGTase通过戊二醛交联，获得重组的交联酶聚集体CGTase（CLEA-CGTase）。在85 ℃下，CGTase活力75 U/mL时，将CGTase与体积分数0.1%戊二醛交联10 min，可以得到固定化效果最佳的CLEA-CGTase。

1.5 其他固定化方法

任意一种酶的固定化方法可能有很多种，但不是每一种方法都适用于任意一种酶，故具有一定的局限性。为获得固定化性能良好的酶，通常将固定化技术中的多种方法结合起来用于酶的固定化。Manab等[25]通过物理吸附法和包埋法在多孔中空纤维膜中将重组大肠杆菌表达的CGTase固定。Matte等[26]以SiO2表面引入氨基为载体，并加入交联剂戊二醛来固定CGTase，得到的固定化酶的酶活回收率达83%，重复使用15次后，酶活仍保持在60%左右。Ibrahim等[27]通过物理吸附和共价连接将CGTase共价固定在氨基化二氧化硅涂覆的用阴离子或阳离子表面活性剂制备的磁性纳米颗粒上。结果表明，用阴离子表面活性剂制备的活性mag@d-SiO2@m-SiO2-NH2共价连接酶固定化效率最高（98.1%），负载效率为96.2%，这是目前报道的最高固定化产率和负载效率之一。此外，固定化CGTase热稳定性和耐酸碱性显著增强，且表现出良好操作稳定性，在10次连续反应后保留初始活性的56%。

黄立萍[28]采用吸附-交联-包埋法对CGTase进行固定化，用介孔分子筛SBA-15吸附，戊二醛交联，海藻酸钠包埋，得到的固定化酶热稳定性和pH稳定性均优于游离酶，重复使用4次后，固定化酶的残余酶活力仍保留50%以上，但由于包埋法制得的凝胶在重复使用过程中易发生泄露，故固定化酶使用4次以后，机械强度下降，该方法得到的固定化酶的重复使用性有待提高。

2 固定化酶的各种方法比较（见表1）

表1 固定化方法的优缺点

3 固定化CGTase的应用

CGTase可以通过环化反应液化淀粉的分子内转糖基来生产环糊精（CD）。Gimenez等[34]通过表面锚定（SCGT-A）和共价结合法（SCGT-CB）将商业CGTase固定在二氧化硅上，并将固定化酶用于CD生产。结果表明，使用SCGT-A比SCGT-CB和游离酶效率更高，在24 h内，SCGT-A产生的CD总数量比SCGT-CB多70.49%，比游离酶多18.15%。通过SCGT-A和SCGT-CB方法获得CD的产量证明，固定化CGTase在工业上的应用是可行的。Schoffer等[35]研究反应条件对固定化β-CGTase生产α-CD、β-CD和γ-CD的影响。结果表明，pH、温度和反应时间对α-CD、β-CD和γ-CD的定向生产具有重要意义。研究提出使用相同的固定化CGTase生产CD可能性，特别是对具有重要工业意义的γ-CD的生产。

CGTase可广泛应用于VC衍生物2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）的生产。AA-2G因稳定性好、安全性高、易被人体吸收等特点，而被认为是最佳VC替代品。AA-2G在人体内可以分解为VC和葡萄糖，因此被广泛应用于食品、化妆品、医疗保健等行业。

由于固定化CGTase比游离CGTase稳定性好、经济效益高，所以固定化CGTase生产AA-2G得到的产量要优于游离酶。单丽媛[36]分别采用包埋法、吸附法、载体结合法来固定化CGTase，3种方法的固定化载体分别是海藻酸钠、聚乙二烯苯小球、壳聚糖，用这3种载体固定化CGTase后，对其转化合成AA-2G的条件进行研究，其中海藻酸钠固定化CGTase转化合成AA-2G产量可达17.18 g/L。

4 结语和展望

由于CGTase在各方面的广泛应用，特别是用于生产CD和AA-2G，使CGTase的需求巨大，因此出现大量关于CGTase的研究，为工业应用奠定基础。对于CGTase固定化方法研究越来越多，但仍存在许多问题，如固定化效率不高、工业应用比较少等，因此采用最佳固定化技术和载体等以提高CGTase的固定化效率及进一步将固定化CGTase应用于工业是未来重点研究方向。