香露兜中2-乙酰-1-吡咯啉的鉴定与定量分析

陈思平 ，郭培培, ，秦晓威，宗迎，黄艳丽 *，夏志强

1.云南农业大学热带作物学院（普洱 665000）；2.中国热带农业科学院香料饮料研究所/农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室/海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室（万宁 571533）；3.四川农业大学园艺学院（成都 611130）；4.中国热带农业科学院热带生物技术研究所（海口 571101）

香露兜（Pandanus amaryllifoliusRoxb.），为露兜树科（Pandanaceae）露兜树属（Pandanus）多年生热带园艺作物，因其叶加于米中蒸食可产生香稻的“粽香”而闻名[1-2]，是热带、亚热带地区广泛使用的一种天然食用调味料。其富含生物碱、多酚、黄酮等活性物质，具有抑制氧化酶活性、降血糖和改善代谢等作用[3-9]。香露兜原产于印度尼西亚马鲁古群岛，我国于20世纪50年代由归国华侨引进并试种成功，目前主要栽培于海南、云南等省区[2]，现已成为海南当地的消费新潮和休闲旅游的特色品牌之一。作为一种深受人们喜爱的天然食用增香料，香露兜长期存在需求旺盛与供应不足的问题，因而具有重要的潜在经济价值和开发前景，对提高边远地区农民收入和生活水平具有重要意义。

2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）又名古吗啉，为淡黄色液体，有增进食欲和改善新陈代谢的作用[3]，是香稻的主要香气贡献物，也是香露兜产生“粽香”的特征致香成分[4,19]。相关研究表明，香露兜中2-AP的含量是香稻中的10倍多[14,20]，高2-AP含量正是其商业价值所在。2-AP的提取有水蒸气蒸馏法[10]、有机溶剂萃取法[11-12]、超临界CO2萃取法[13-14]等，但鲜有对多种提取方法进行比较的报道。国内外采用气相色谱（GC）技术[16]、气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）技术[14-15]、气相色谱-质谱联用（GCMS）技术[10,13,17]、高效液相色谱（HPLC）技术[18]、液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术[19]等对2-AP的定性和定量分析开展了广泛的研究，能够较好地满足2-AP的检测要求，但多集中在香稻的研究上，对香露兜中2-AP的分析研究相对较少。而且，随着大型分析仪器的普及，超高效液相色谱（UPLC）技术在定量分析方面具有更高的灵敏度和准确度，不需要对样品进行富集即可检测，与GC、HPLC等相比更加快速高效。为对香露兜中的特征香气成分2-AP进行鉴定和定量分析，此次试验以海南引种栽培的香露兜为材料，比较分析乙醇溶剂（75%和100%两种不同比例）的3种不同提取方法（蒸馏法、浸提法和超声波辅助法）对香露兜中2-AP提取效率的影响，利用GC-MS技术结合保留指数对样品中2-AP进行鉴定，并在此基础上采用灵敏度更高的UPLC技术对2-AP含量进行更加准确的定量分析，旨在为2-AP检测标准的编订、香露兜的资源评价和香露兜产品的质量控制提供科学依据。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Aglient-7890/5977B GC-MS联用仪、Agilent 1290超高效液相色谱仪配备DAD检测器（美国安捷伦公司）；Pall-cascada纯水/超纯水一体化机系统（美国颇尔公司）；电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）；S6000超声波清洗机（东莞市墨洁超声波设备公司）。

2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）标准品（≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司）；C7～C30正构烷烃混标准品（上海安谱实验科技有限公司）；75%乙醇、100%乙醇（分析纯，山东利尔康医疗公司）；乙醇、甲醇（色谱醇，西陇科学公司）；水（娃哈哈纯净水）。

供试样品香露兜采自海南兴隆热带植物园，经秦晓威副研究员鉴定为露兜树科露兜树属植物香露兜Pandanus amaryllifoliusRoxb.。

1.2 方法

1.2.1 香露兜中2-AP的提取

选取成熟、无病虫害和无机械损伤的香露兜新鲜叶片，清洗晾干，切碎并混匀，备用。分别采用蒸馏法、浸提法、超声波辅助法进行提取，每种方法又采用75%和100%两种不同体积分数的乙醇分别作萃取溶剂。每种提取方式均重复3次。

蒸馏法：精密称取40 g样品于圆底烧瓶中，加入500 mL乙醇溶剂，保持微沸状态蒸馏提取4 h，收集馏出液，除水，待测。

浸提法：精密称取40 g取样品于锥形瓶中，加入500 mL乙醇溶剂，常温下浸提4 d，过滤，除水，待测。

超声波辅助提取法：精密称取40 g样品于锥形瓶中，加入500 mL乙醇溶剂，在50 ℃下超声波辅助提取40 min，过滤，除水，待测。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取15.35 mg 2-AP标准品，置于10 mL容量瓶中，用UPLC级乙醇溶剂溶解，定容，得质量浓度为1.535 mg/mL的标准贮备液，于-18 ℃避光贮存。准确移取适量上述标准贮备液，稀释成500，300，150，100，50和30 μg/mL梯度标准工作溶液，现用现配。

1.2.3 UPLC样品供试液的制备

准确称取5.00 g 1.2.1小节中香露兜样品于20 mL容量瓶中，加入UPLC级乙醇溶剂，定容至刻度线。在50 ℃下超声波辅助提取40 min，过滤，提取液加入无水硫酸钠除水，经0.22 μm有机膜过滤，按1.2.4条件上机测定。

1.2.4 GC-MS和UPLC仪器分析条件

GC分析条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气位高纯度He2（99.999%）；流速1 mL/min，不分流；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至100 ℃，再以6 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min；进样量10 μL。

质谱条件：离子源电离方式EI；电子能量70 eV；MS四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃；扫描质量范围m/z30～450。

UPLC分析条件：色谱柱Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 Micron）；流动相为甲醇-水9∶1，流速0.5 mL/min；检测波长206 nm；进样量5 μL；左右柱温箱25 ℃。

1.2.5 保留指数（IT）的计算

式中：z和z+1分别为目标化合物（2-AP）流出前后的正构烷所含碳原子的数目；TR(2-AP)，TR(z)和TR(z+1)分别代表2-AP及碳原子数为z和z+1正构烷的保留温度，且TR(z)＜TR(2-AP)＜TR(z+1)。

2 结果与讨论

2.1 香露兜中2-AP提取方法的优化

如图1所示，比较乙醇溶剂（75%和100%两种不同比例）的3种提取方法（蒸馏法、浸提法和超声波辅助法）共6种不同提取方式对香露兜中2-AP提取效率的影响，GC检出的2-AP峰面积存在显著性差异（p＜0.05）。其中，超声波辅助100%乙醇溶剂提取法检出的2-AP峰面积最大。

乙醇溶剂对2-AP溶解度比丙醇、甲醇高[12]，且安全、毒性低。香露兜中2-AP的提取法较多采用水蒸气蒸馏法[10]和有机溶剂萃取法[11-12,20]。超声波辅助提取法利用超声波破坏植物细胞组织，加大了溶剂的渗透作用，提取效率较高，比蒸馏法减少了热降解、热挥发的损失，比浸提法提取得更充分。故采用超声波辅助100%乙醇萃取法提取香露兜中的2-AP，以获得较高的提取效率。

图1 2-AP不同提取方式下气相色谱峰面积图

2.2 香露兜中2-AP的GC-MS鉴定

如图2所示，在1.2.4项检测条件下，2-AP标准品和样品质谱扫描均得到较丰富的离子碎片信息，离子碎片特征质荷比均在同一位置出现，其特征离子峰质荷比为m/z111，83，68，69，55，52，42，43和41，分子离子峰为m/z111。2-AP样品质谱信息与标准品匹配度达90.4%。

如图3所示，在1.2.4项检测条件下，目标化合物2-AP色谱峰分离度良好，2-AP标准品保留时间t标=（12.324±0.18）min，样品中2-AP保留时间t样=（12.529± 0.24）min。由1.2.5项保留指数公式计算得2-AP的实际保留指数1 331±2，参考保留指数为1 330±7。2-AP的实际保留指数在参考保留指数范围内。

GC-MS可对某个特定成分进行鉴定和定量分析[17-19]。GC-MS在鉴定香露兜特征香气成分2-AP的同时，还可检测出香露兜中角鲨烯、叶绿醇等其他香气成分[12-14]；而在定量分析上，UPLC比GC灵敏度高，更加快速高效。因此，确定分别采用GC-MS和UPLC对香露兜中2-AP进行鉴定和定量分析。

图2 2-AP标准品MS谱图（A）和样品MS谱图（B）

图3 2-AP标准品GC谱图（A）和样品GC谱图（B）

2.3 2-AP的UPLC定量分析

2.3.1 检测波长的选择

2-AP标准品在UPLC检测器DAD下光谱全扫描，结果如图4所示。2-AP在206 nm波长处有最大吸收峰，且干扰较少。确定选择λ=206 nm作为2-AP定量分析波长。

图4 2-AP全波长扫描图

2.3.2 2-AP的UPLC色谱图

在λ=206 nm处，2-AP标准品和样品按1.2.4项仪器工作条件进样检测，结果如图5所示。2-AP标准品保留时间t标=5.345 min，样品保留时间t样=5.316 min。样品和标准品保留时间一致。

图5 2-AP标准品UPLC色谱图（A）和样品UPLC色谱图（B）

2.3.3 线性范围、检出限和定量限

1.2.2 项系列标准液在1.2.4项检测条件下进样分析，以色谱峰面积x为横坐标，浓度y为纵坐标，绘制2-AP标准曲线，得线性回归方程y=0.351 2x+5.018 8，相关系数r2=0.999 5。结果表明，2-AP在30～500 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

以信噪比S/N≥3和S/N≥10分别计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），测得LOD为0.005 14 mg/mL，LOQ为0.017 1 mg/mL。

2.3.4 精密度、稳定性和重复性试验

取2-AP标准品和1.2.3项样品供试液，各1份，按1.2.4项仪器工作条件，分别连续进样6次，进行精密度试验。记录2-AP峰面积，计算得标准品δRSD为1.35%，样品δRSD为1.43%。

取2-AP标准品和1.2.3项样品供试液，各1份，按1.2.4项仪器工作条件，1 d内分别在0，2，4，8，12和24 h进样，进行稳定性试验。记录2-AP峰面积，计算得标准品δRSD为0.98%，样品δRSD为1.80%。

取2-AP标准品和1.2.3项样品供试液平行样，各6份，按1.2.4项仪器工作条件进样检测，进行重复性试验。记录2-AP峰面积，计算得标准品δRSD为1.08%，样品δRSD为1.54%。

精密度、稳定性和重复性试验中，δRSD＜2%，均在可接受标准内。

2.3.5 样品加标回收率与相对标准偏差

取9份已知2-AP含量的样品供试液，分成3组（每组3份），分别按80%，100%和120%水平加入2-AP标准液，按照1.2.4项仪器工作条件进样检测，以外标法计算2-AP含量，结果如表1所示。样品加标回收率在92.6%～98.6%之间，3个水平δRSD分别为3.23%，2.35%和0.95%。该方法满足GB/T 27404—2008附录F[21]的要求，可用于香露兜中2-AP的定量分析。

表1 方法回收率及相对标准偏差（n=9）

2.4 实际样品的分析

表2 香露兜样品中2-AP的含量（n=6）

按1.2.3项制备6份样品供试液平行样，按1.2.4项仪器工作条件进样，UPLC测定结果如表2所示。根据1.2.3项样品供试液制备工艺，计算得香露兜中2-AP含量为637.8 mg/kg。香露兜成熟鲜叶中富含2-乙酰-1-吡咯啉。

3 结论

此次试验建立了超声波辅助100%乙醇提取、气相色谱-质谱（GC-MS）鉴定、超高效液相色谱（UPLC）定量分析香露兜中特征香气成分2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的检测方法。采用该方法测得香露兜成熟鲜叶中2-AP含量高达637.8 mg/kg。该方法准确度高，灵敏度、可靠性等均符合理化检测检验方法确认的技术要求，适用于香露兜中2-AP的鉴定和定量分析，为2-AP相关检测标准的编订提供了技术支持，也为香露兜的资源评价、产品质量控制提供了科学依据。