超高效液相色谱-串联质谱法测定甘蔗中11种多酚类物质

王小鹏，黄敏兴*，许卓妍，杨李胜，刘志鹏，余构彬

(1广东省科学院生物工程研究所，广东广州510316；2中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心，广东广州510316)

0 前言

植物类多酚是多羟基酚类化合物的总称，是一类广泛存在于植物体内具有独特生物活性的次生代谢物。作为植物天然产物，植物多酚因其结构的多样性而具有多种生物活性[1]。近年来，植物多酚的生物活性及功能性作用不断被挖掘。相关研究表明，植物多酚具有清除自由基、抗氧化、食品保鲜、抑菌抗菌、抗病毒、抑制癌症、治疗心脑血管疾病等多种功能性作用[2-4]。随着植物多酚研究领域往纵深方向发展，进一步细化多酚物质的分类以及功能性作用具有深远意义。而高效高灵敏度的定性定量检测方法能够明确多酚的组分组成及各组分的含量，是多酚功能性作用走向精细化研究的重要技术支撑手段。因此针对不同植物基质特性，开发专属性较强的高效高灵敏度检测方法具有重要意义。

甘蔗是我国重要的经济作物，也是食糖生产的重要来源，年产量居世界第 3，但与外国制糖产业相比，我国甘蔗制糖产业整体经济效益存在一定差距，主要体现在综合利用率不高，甘蔗及其副产物资源高值化利用率相对较低，因此提高甘蔗及其副产物的高值化利用将成为提升甘蔗制糖行业整体经济效益的必经之路。甘蔗组织中含有丰富的多酚物质，提取甘蔗多酚并进行功能性应用研究将是甘蔗高值化利用的重要途径[5-7]。

甘蔗中多酚定性定量检测方法是功能性应用研究的重要技术支撑手段，但当前甘蔗多酚检测方面的研究主要集中在提取阶段，高效高灵敏度的多组分多酚检测方法研究相对较少。目前多酚物质的检测方法主要有高效液相色谱法[8-10]、气相色谱-质谱法[11-12]、液相色谱-质谱法[13-15]等。高效液相色谱法易受复杂基质的干扰，对分析多种多酚具有一定的局限性。而液相色谱-质谱法具有强大的抗干扰能力，灵敏度高，可以准确定性定量。本文拟以甘蔗为研究对象，建立甘蔗中11种多酚的超高效液相色谱串联质谱检测方法，以期为甘蔗多酚的功能性应用研究提供技术支撑手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Altus A-30超高效液相色谱仪(美国铂金埃尔默公司)，5500 Qtrap质谱仪(美国Sciex公司)，色谱柱Atlantis T3 (3 μm，150 mm×3.0 mm)(美国沃特世公司)；WIGGENS Vortex 3000涡旋振荡器(北京桑翌实验仪器研究所)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；H1850R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

11种多酚标准品(≥99.5%，上海安谱实验科技股份有限公司)；甲醇(色谱纯，默克股份两合公司)；甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)；0.22 μm有机相滤膜(广州彼西络科技有限公司)。

1.2 样品前处理

将广州市面上采购的新鲜甘蔗洗净，放入搅拌机搅碎，称取2.00 g(精确到0.01 g)样品于50 mL离心管中，准确加入20 mL甲醇，涡旋10 min，40℃超声60 min，以5000 r/min速度离心5 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，待上机。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～1.0 min，90% A；1.0～5.0 min，90%～10% A；5.0～8.5 min，10% A；8.5～8.6 min，10%～90% A；8.6～10.0 min，90% A；流速：0.5 mL/min；柱温：40℃；进样量：1 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾负离子电离(ESI-)；多反应监测(MRM)；喷雾电压：-4500 V；离子源温度：550℃；雾化气压力：55 psi；气帘气压力：44 psi；辅助加热气压力：40 psi；碰撞气压力：中档。定量和定性离子、去簇电压等参数见表1。

2 结果与分析

表1 11种多酚物质的相关质谱参数

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择

实验比较了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm ×2.1 mm)、Ultra AQ C18(3 μm，100 mm×2.1 mm)、Atlantis T3 (3 μm，150 mm×3.0 mm)3 种不同色谱柱对 11种多酚物质的分离效果。结果表明，Atlantis T3色谱柱对11种多酚物质较另外2种色谱柱具有更好的保留和分离效果，目标化合物峰形不会出现分叉，拖尾现象不明显，响应值高，3种色谱柱的分离效果见图1～3，因此，本实验选用Atlantis T3色谱柱。

2.1.2 流动相的选择

图1 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱对11种多酚物质分离效果

图2 Ultra AQ C18色谱柱对11种多酚物质分离效果

图3 Atlantis T3色谱柱对11种多酚物质分离效果

采用针对极性物质分析效果较好的Atlantis T3(3 μm，150 mm×3.0 mm)色谱柱，分别比较了超纯水-乙腈、0.01%氨水-乙腈、0.01%氨水-甲醇、超纯水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇 5种不同流动相组合的分离效果。结果表明，采用0.1%甲酸水-甲醇流动相组合能最大程度上调节酸度，抑制解离，提高灵敏度，且峰形尖锐对称，分离度好，故选择 0.1%甲酸水-甲醇作为本实验的流动相。

2.2 前处理条件的优化

本实验采用溶剂萃取法结合超声萃取法。多数文献[16-17]采用丙酮、乙酸乙酯、甲醇分步提取多酚物质，本实验通过加标回收实验比较后精化了提取步骤，只用甲醇作为提取溶剂。为了进一步探究提取溶剂浓度(60%甲醇水、80%甲醇水、100%甲醇)、超声时间(30、60、120 min)、超声温度(40、60、80℃) 3个因素3个水平对最终实验的影响，利用正交设计助手软件进行正交实验设计，对设计出来的 9个具有代表性的组合进行加标实验探究，具体正交设计实验结果见表2。当选择纯甲醇(100%甲醇)作为提取溶剂，温度40℃超声60 min时可以达到最佳提取效果，平均加标回收率为93.2%。

2.3 回收率和精密度

表2 正交设计实验结果表

采用逐级稀释法结合3倍浓度除以信噪比计算得到 11种多酚物质的检出限。在空白样品中加入100 μg/kg的11种多酚标准溶液进行加标回收实验，平行测定6次，结果见表3。当线性范围为5～200 μg/L时，其相关系数在0.9990～1.0000之间，检出限在0.5～17.0 μg/kg之间，回收率在89.4%～102.4%之间，精密度在0.9%～4.3%之间。

2.4 样品分析

对来自广东不同种植区域采集的6份甘蔗样品进行不同部位的试验分析，结果见表4。结果表明，6份甘蔗样品均检出香草酸、绿原酸、对香豆酸、儿茶素、阿魏酸、没食子酸、咖啡酸、槲皮素、原花青素B2，未检出表儿茶素、反邻香豆酸。

3 结论

表3 线性范围、线性方程、相关系数、检出限、回收率和精密度(n=6)

表4 11种多酚类物质在甘蔗中的检测结果 单位：mg/kg

本研究通过对前处理、色谱、质谱等条件的优化，建立了一种超高效液相色谱-串联质谱测定甘蔗中11种多酚类物质的方法，该方法简便、快速、高效，且回收率及精密度均满足实验要求，选择性强，适应性良好，可用于甘蔗中多酚类物质含量的批量测定。同时也为甘蔗各部位的充分利用、有益物质开发、组织培养降低酚害提供了技术参考。