安荔赤眼蜂在中国野外首次发现及其体内Wolbachia的检测

肖庄婷, 王德森, 何余容

(华南农业大学昆虫学系, 广东省生物农药创制与应用重点实验室, 生物防治教育部工程技术研究中心, 广州 510642)

赤眼蜂Trichogramma隶属膜翅目(Hymenoptera)小蜂总科(Chalcidoidea)赤眼蜂科(Trichogrammatidae)，是农林害虫的重要寄生性天敌。赤眼蜂种类繁多，分布遍及全球，全世界目前发现的有180余种(Pinto, 1999)，我国已记录的有29种(何晓芳等, 2005)。已经被成功运用于玉米、棉花、蔬菜、甘蔗、果树和森林的多种害虫生物防治中，并且取得了显著的经济效益和生态效益(Smith, 1996)。在我国，近30年来赤眼蜂已成为应用范围最广、应用面积最大、防治对象最多的一类天敌。

赤眼蜂蜂种采集和种类的准确鉴定是赤眼蜂研究和应用的基础。 赤眼蜂体型微小，成虫体长0.2～1.2 mm，前翅宽圆，翅脉呈“S”形弯曲，翅面纤毛排列成行；雌雄触角异型，雌虫触角7节，雄虫触角5节且具长刚毛(林乃铨, 1994)。赤眼蜂属的种间鉴别最早是根据其体色、翅毛等外部形态进行的。但Flanders和Quednau(1960)发现赤眼蜂的形态特征会随寄主及温度的不同而改变，并通过实验发现只有在严格控制温度与选定寄主的情况下饲养的赤眼蜂才可依据其外部形态特征鉴定种类，显然这种方法在实际研究中很难进行，不足以成为鉴别的依据。在赤眼蜂的现代形态学分类中，雄性外生殖器是主要的分类依据(Nagaraja and Nagarkatti, 1969; Nagarkatti and Nagaraja, 1977)。Doutt和Viggiani(1968)通过大范围研究世界各地已发现的赤眼蜂种类，经过深入系统地对比分析制定了一套赤眼蜂的分类检索表，由此形成了较为精确可靠的分类系统。然而赤眼蜂的形态鉴定费时费力，未经深入系统的学习往往难以胜任。此外，在野外采集过程中，赤眼蜂成虫很难采集到，而寄生卵(赤眼蜂幼期)则更容易获得。再者，被内共生菌Wolbachia感染后的赤眼蜂主要营产雌孤雌生殖，缺少用于形态鉴定的雄性个体(潘雪红等, 2007)，若要得到雄性个体，还需通过高温或抗生素等方法进行处理。因此，仅仅依靠成虫的形态特征来进行赤眼蜂的种类鉴定，尚存在一定的局限性。

近年来，随着分子技术的长足发展，越来越多的分子鉴定技术被应用于赤眼蜂的分类鉴定。ITS2序列已被用于赤眼蜂物种鉴定和系统发育方面的研究，Almeida和Stouthamer(2003)对rDNA-ITS2序列进行扩增、克隆、测序和比对后实现了对秘鲁的卷蛾赤眼蜂Trichogrammacacoeciae的鉴定。在国内，李正西和沈佐锐(2001, 2002)对拟澳洲赤眼蜂Trichogrammaconfusum、广赤眼蜂Trichogrammaevanescens等6种常见赤眼蜂的rDNA-ITS2进行了克隆测序，利用序列比对发现ITS2可以用于赤眼蜂种一级的分子鉴定。目前，在NCBI数据库中，已积累了72个赤眼蜂命名种的ITS2序列。因此，形态学与分子生物学相结合，成为了当前赤眼蜂种类鉴定的重要方法。

Wolbachia是一种革兰氏阴性细菌，具杆状和球状两种形态，属于变性菌纲 (Proteobacteria)α亚群、立克次氏体科(Richettsiaceae)和Wolbachia属，具有较高的遗传多样性，可以诱导宿主生殖过程中细胞质不亲和、孤雌生殖和遗传上雄性雌性化来调节宿主后代的种群(Sioziosetal., 2008; Ahmedetal., 2016)。Wolbachia表面蛋白基因(Wolbachiasurface protein gene,wsp)的进化速度快，具有很高的序列多态性，基于wsp序列曾建立起一套较为完善的Wolbachia分类系统。Pintureau等(2000)基于wsp基因对短管赤眼蜂T.pretiosum、T.deion和食胚赤眼蜂T.embryophagum等7种赤眼蜂体内Wolbachia构建了系统发育树并认为这7种赤眼蜂均被wSib感染；宋月等(2010)通过对Wolbachia特异的wsp基因PCR扩增及测序，发现采自华南、华北不同寄主的螟黄赤眼蜂Trichogrammachilonis4个地理种群全部感染Wolbachia，Wolbachia分属A大组的Kue组及B大组的Pip组，且双重感染率达到了100%。到目前，在GenBank中登录注册的Wolbachiawsp基因序列已有200多个，为Wolbachia系统发育和进化关系的研究提供了基础资料。但由于Wolbachia的基因组内具有很高的重组率，应用单一基因的序列信息不能全面反映Wolbachia类群之间的系统进化关系(Baldoetal., 2006a)，因此，Baldo等(2006b)从候选的46个基因中筛选出多位点序列分型 (multilocus sequence typing, MLST)的5个基因(gatB,coxA,hcpA,ftsZ,fbpA)，为Wolbachia开发了一个标准的MLST系统，该系统广泛应用于各种单一感染宿主物种的Wolbachia菌株，对Wolbachia进行鉴定、分型及系统聚类分析。

本研究以野外诱集到的赤眼蜂为研究对象，对采集的赤眼蜂进行形态鉴定并结合rDNA-ITS2测序，实现对野外赤眼蜂准确有效的鉴定。利用Wolbachia的wsp序列以及MLST引物检测该赤眼蜂的Wolbachia感染情况，基于wsp和MLST对检测到的Wolbachia进行同源性分析并构建系统发育树。研究结果为将来在田间进行害虫防控提供了科学依据，为后续探明Wolbachia与赤眼蜂互作的分子机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 蜂种野外采集

赤眼蜂的蜂种采集时间为2018年5月至2019年2月，采集地点位于华南农业大学树木园(23.16°N, 113.36°E)内，采集频率为每月采集1次。具体的采集方法如下：在树木园内随机选取10点悬挂10 mm×30 mm米蛾Corcyracephalonica卵卡(由新鲜米蛾卵用胶水均匀粘于坐标纸上制成，在紫外灯下照射60 min 杀胚)，卵卡用双面胶贴于塑料杯内壁上，将塑料杯倒置、并悬挂于树枝上，距离地面1.5 m。塑料杯杯口用纱网封住，防治蚂蚁等其他昆虫取食米蛾卵。

7 d后取回卵卡，放置在人工气候箱(温度26±1℃，相对湿度60%±10%，光周期12L∶12D)中培养，直至蜂完全羽化。羽化后的成蜂用30%蜂蜜水饲喂，1 d后将单头雌蜂引入小指形管中，并放入10 mm×5 mm大小的米蛾卵卡供其寄生。1 d后取出卵卡，放入新的小指形管中，待后代羽化后，鉴定种类，统计雌雄比，若后代全为雌性则将雌蜂后代单管分离建立单雌品系。

1.2 蜂种鉴定

1.2.1形态鉴定：为获得用于形态鉴定的赤眼蜂雄性个体，将1.1节建立的单雌品系后代通过30℃高温连续处理2代，对获得的雄性个体在体式显微镜下进行外生殖器解剖。具体步骤：首先，配制荷氏液(Hoyer’s medium)及醋酸乳酸酚浸液各1份；然后，将赤眼蜂标本在醋酸乳酸酚浸液中浸泡6～12 h；最后，待标本透明后移至载玻片上，在荷氏液中解剖、整姿，封片拍照(林乃铨, 1994)。证据标本保存于华南农业大学植物保护学院生物防治实验室。

1.2.2分子鉴定：赤眼蜂基因组的提取方法采用天根生化科技(北京)有限公司的血液细胞组织基因组试剂盒，提取后用NanoDrop微量核酸/蛋白检测仪测定各DNA样品的浓度及纯度，检测合格后DNA保存于-20℃备用。对赤眼蜂核糖体核糖核酸基因第2内部转录区(ITS2)片段进行扩增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司参考已报道的安荔赤眼蜂TrichogrammaoleaeITS2序列(GenBank登录号: DQ389070.1)合成。引物序列：上游引物5′-CTGGCTGAGGGTCTGTTAT-3′；下游引物5′-CTTGCBDHTCGYTTRAGGC-3′。本实验采用的反应体系(50 μL): ddH2O 36 μL, PCR Buffer 5 μL, dNTPs(2.5 μmol/L)4.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板2 μL, rTaq(5 U/μL)0.5 μL。空白对照不加DNA模板。PCR反应条件: 94℃预变性2 min; 94℃变性30 s, 50℃退火50 s, 72℃延伸90 s, 循环38次；72℃延伸10 min，产物在4℃保存。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，电泳结束后置于凝胶成像系统下观察并拍照记录。PCR产物送广州擎天生物技术有限公司进行双向测序。

测序结果用核苷酸序列分析软件MEGA5.04对序列进行拼接剪裁，在GenBank中作BLAST比对，比对确认后的序列进行赤眼蜂系统发育的分析，选取ITS2完整序列，利用邻接(neighbor-joining)法构建系统发育树，最后运用boostrap 1 000次重复进行检验。

1.3 赤眼蜂Wolbachia感染检测

PCR扩增Wolbachia的wsp，对采集到的15头赤眼蜂样品进行Wolbachia感染情况分析，计算感染率。引物序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应采用体系(25 μL): ddH2O 9.5 μL, 1.2.2节提取的DNA模板1 μL,2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR扩增条件: 94℃预变性2 min; 94℃变性30 s, 59℃退火50 s, 72℃延伸90 s, 循环38次; 72℃延伸10 min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳后染色观察，于凝胶成像系统下观察并拍照记录，将目的片段的PCR产物进行回收、纯化后，交由公司进行双向序列测定。

1.4 赤眼蜂体内Wolbachia系统发育分析

从GenBank中下载31条其他昆虫以及其他赤眼蜂品系或种群体的Wolbachiawsp序列，连同1.3节获得的Wolbachia的wsp序列，利用MEGA5.04软件的最大似然法(ML)构建系统发育树，采用Kimura 2-Parameter模型计算遗传距离，位点间变异率采用G位点间变化的离散Gamma分布，其他参数设置为默认值，检验支持率的重复性抽样分析(bootstrap analysis)参数设置为1 000次。

1.5 赤眼蜂体内Wolbachia MLST序列分型

进行MLST(Wolbachia管家基因gatB,coxA,hcpA,ftsZ和fbpA)序列分型，引物序列见表1，PCR反应体系(25 μL): ddH2O 9.5 μL, 1.2.2节提取的DNA模板1 μL, 2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。反应程序: 94℃预变性2 min; 94℃变性30 s, Tm退火50 s, 72℃延伸90 s, 循环38次; 最后72℃延伸10 min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳后染色观察，于凝胶成像系统下观察并拍照记录。将目的片段的PCR产物切胶纯化回收，采用北京擎天新业生物技术有限公司pClone007 Simple Vector试剂盒进行连接转化，将纯化产物连接至pClone007 Simple Vector，然后转化到大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，经菌液PCR鉴定含有目的片段后，交由公司进行双向序列测定。用核酸序列分析软件MEGA5.04对序列进行手工检查核对并拼接剪裁，在NCBI上作BLAST比对，比对确认后将测序结果全部提交到PubMLST等位基因谱和wsp的基因谱，得到感染Wolbachia的序列型(ST)。利用IQ-Tree，基于获得的PCR扩增序列构建MLST多基因联合ML系统发育树(Nguyenetal., 2015)，用ModelFinder进行单基因最佳模型筛选(Kalyaanamoorthyetal., 2017)，利用FigTreev1.4.0进行可视化。

2 结果

2.1 赤眼蜂形态鉴定

本实验共采集到两批赤眼蜂，采集时间分别为2018年5月和10月，被寄生的米蛾卵分别为11粒和9粒，羽化出蜂数分别为9头和6头，羽化蜂均为雌蜂。在其他的采集月份，存在米蛾均被昆虫(蚂蚁等昆虫)啃食、发霉等现象，导致未能采集到赤眼蜂。在实验室条件下，进一步的扩繁结果显示所采集的15头雌蜂产雌率均为100%，推测为产雌孤雌生殖。

图1 本研究观察的赤眼蜂雌蜂Fig. 1 Female adults of Trichogramma observed in this studyA, B: 产卵前行为Behavior before oviposition; C: 背部观Dorsal view; D: 腹部观Ventral view.

雌蜂(图1)体色微黄褐色，腹部为黑褐色，前足腿节两端与胫节及各跗节、中后足腿节与胫节两端及第1和2跗节褐色；翅透明；头顶区若干短刺毛；产卵管略短于后胫节。

15个单雌品系后代通过30℃高温连续处理2代后获得了多个雄性后代，其雄性外生殖器(图2)阳基背突高度骨化，广三角形，有较宽圆弧形侧缘，基部收窄，腹中突基部至阳基侧瓣末端的距离(D)的长度近于阳基全长的1/3，腹中突成锐角三角形，其长度为D的2/5；钩爪末端突出于阳基侧瓣之外；阳茎稍长于内突，两者之和明显近于阳基全长，短于后足胫节。该特征与Voegelé 和 Pointel(1979)描述的TrichogrammaoleaeVoegelé & Pointel的雄性外生殖器一致。据此将诱集到的赤眼蜂种鉴定为安荔赤眼蜂T.oleae。

2.2 赤眼蜂分子鉴定

将扩增的ITS2的测序结果用MEGA5.04分析软件对序列进行拼接后在 NCBI上进行比对，发现与已报道的安荔赤眼蜂ITS2序列(GenBank登录号: DQ389070.1)一致性为100%，并将获得的ITS2完整序列提交GenBank注册，登录号为MT738247。

图2 赤眼蜂雄蜂外生殖器形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of external genitaliaof male adults of TrichogrammaCS: 钩爪Chelate structures; D: 腹中突基部至阳基侧瓣末端的距离Length between the base of MVP and GF; DEG: 阳基背部Dorsal expansion of gonobase; GF: 阳基侧瓣Apex of gonoforceps; MVP: 腹中突Median ventral projection.

选择邻接法对采集到的安荔赤眼蜂的ITS2全序列以及从GenBank中下载的赤眼蜂品系或种群ITS2全序列构建系统发育树(图3)。结果表明，基于ITS2核苷酸序列，本研究的安荔赤眼蜂和其他品系或地理种群的安荔赤眼蜂聚在一起。ITS2序列分析结果支持将本研究从野外采集获得的赤眼蜂材料鉴定为安荔赤眼蜂T.oleae。

图3 邻接法构建的基于ITS2核苷酸序列的赤眼蜂品系或种群系统进化树(1 000次重复)Fig. 3 Phylogenetic tree of Trichogramma strains or populations by neighbor-joining methodbased on nucleotide sequence of ITS2 (1 000 replicates)

2.3 基于wsp基因的安荔赤眼蜂体内Wolbachia系统发育

将PCR扩增的wsp序列的测序结果用MEGA5.04分析软件对序列进行拼接后，在 NCBI上进行比对并将序列提交GenBank注册，登录号为MW006098。PCR检测结果显示，所采集的安荔赤眼蜂均感染了共生菌Wolbachia，感染率为100%。从系统发育建树上(图4)可以清晰地看到Bootstrap值为100大于70，说明构建的进化树可信度较高，所测得的安荔赤眼蜂体内Wolbachia与安荔赤眼蜂(前南斯拉夫品系)、短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum(乌拉圭品系)以及Trichogrammadeion(荷兰品系)体内Wolbachia亲缘关系较近，属于B超组中的Sib亚组。

图4 最大似然法构建的基于wsp核苷酸序列的不同种昆虫体内Wolbachia系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of Wolbachia from different insect species by maximum likelihood methodbased on nucleotide sequence of wspWolbachia来源昆虫种Origin insect species of Wolbachia: MW006098: 安荔赤眼蜂Trichogramma oleae from Guangzhou; AF245166: 安荔赤眼蜂Trichogramma oleae (前南斯拉夫品系Former Yugoslavia line); MG255146: 短管赤眼蜂T. pretiosum(乌拉圭品系Uruguay line); AB094397: 松毛虫赤眼蜂 Trichogramma dendrolimi; AF071925: Trichogramma deion(荷兰品系Netherlands line); AF071927.1: 蚬蝶赤眼蜂Trichogramma kaykai; AF245164: 科尔多瓦赤眼蜂Trichogramma cordubensis; AF071923: Trichogramma sibericam; AF245167: 广赤眼蜂Trichogramma evanescens; AF020084: Trichogramma deion; AF245162: 显棒赤眼蜂Trichogramma semblidis; AF071926: 欧洲玉米螟赤眼蜂Trichogramma nubilale; AF394235: 松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi; AY311486: 螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis; EU399644.1: 棉铃虫Helicoverpa armigera; AM999887.1: 食胚赤眼蜂Trichogramma embryophagum; EU399642.1: 米蛾Corcyra cephalonica; EU399641.1: 柞蚕Antheraea pernyi; AY641091: 螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis; AY633579: 玉米螟赤眼蜂Trichogramma ostriniae； AY390279: 广赤眼蜂Trichogramma evanescens; AF071913: 摩洛哥赤眼蜂Trichogramma bourarachae; AF071912: 蚬蝶赤眼蜂Trichogramma kaykai; AF452644: 卷蛾赤眼蜂Trichogramma cacoeciae; EU399635.1: 杨扇舟蛾Clostera anachoreta; EU399633.1: 腎斑尺蛾 Ascotis selenaria; EU399636.1: 甘薯天蛾Herse convolvuli; EU399634.1: Chiasmia cinerearia; AY377733.1: 甘蓝夜蛾赤眼蜂Trichogramma brassicae; EU399640.1: 黄刺蛾Cnidocampa flavescens; EU399639.1: Pandemis dumetana; EU399638.1: 梨小食心虫Grapholitha molesta. A, B: 分别为A超组和B超组Supergroups A and B, respectively; Sib, Dei, Pip, Sem, Eva, Kue: 分别为亚组Subgroups.

2.4 基于MLST的Wolbachia株系分型及系统发育

在确定感染Wolbachia的安荔赤眼蜂个体中分别扩增管家基因coxA,fbpA,ftsZ,gatB和hcpA片段，将测序结果用MEGA5.04分析软件对序列进行拼接后，在NCBI上进行比对并将序列提交GenBank注册，登录号分别为MW006093, MW006094, MW006095, MW006096和MW006097。Wolbachia数据库在线比对结果显示，野外采集的安荔赤眼蜂种群所感染的Wolbachia序列型为ST486(表2)。系统发育分析结果表明，在B超组中，安荔赤眼蜂体内的wSib株系与T.deion体内的wDei株系聚为一支，遗传距离为0.006，表明wSib株系与wDei株系为两个亲缘关系很近的亚群(图5)，这一结果与图4基于wsp基因构建的Wolbachia系统发育树所显示的结果一致。

表2 安荔赤眼蜂体内Wolbachia 株系的MLST等位基因谱及序列型Table 2 MLST allelic profiles and sequence types (ST)of Wolbachia strains detected from Trichogramma oleae

图5 基于MLST基因序列的不同种昆虫体内Wolbachia系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of Wolbachia from different insect species based on MLST gene sequencesWolbachia来源昆虫种Origin insect species of Wolbachia: Cqui_B ST9.ID30: 尖音库蚊Culex pipiens; wBol1 ST125.ID40: 幻紫斑蛱蝶Hypolimnas bolina; Ekue_B ST20.ID31: 地中海粉螟Ephestia kuehniella; Ccep_B_BJ ST41.ID1631: 米蛾Corcyra cephalonica; wLvict ST306.ID507: Leptopilina victoriae; Osca_B ST27.ID32: Ostrinia scapulalis; wDei ST31.ID35: Trichogramma deion; wSib ST486: 安荔赤眼蜂Trichogramma oleae; wLclav ST303.ID342: Leptopilina clavipes; wRu3 ST265.ID423: 小腹茧蜂属Microgaster; Bmal_D ST35.ID37: 马来丝虫Brugia malayi; Clec_F ST8.ID36: 温带臭虫Cimex lectularius; Drec_A ST13.ID9: 果蝇Drosophila recens; Zang_H ST90.ID207: 白蚁Zootermes angusticollis. MLST: 多位点序列分型Multilocus sequence typing. A, B, D, F, H: 超组Supergroups. 各分支标记为Wolbachia寄主名称、所属超组及序列型。The host name, supergroup and sequence type (ST) of Wolbachia are marked on each branch.

3 讨论

原广东省昆虫研究所李丽英教授从法国引进了安荔赤眼蜂T.oleae，长期保种于原广东省昆虫研究所(现广东省动物研究所)，华南农业大学博士研究生曾赞安2006年曾在实验室对其大量繁殖，并引进到香港特别行政区用于防治荔枝蒂蛀虫Conopomorphasinensis(曾赞安等, 2007)。本研究通过形态和分子鉴定将2018年5月和10月在华南农业大学树木园(该园靠近荔枝种植园)采集到的赤眼蜂材料鉴定为安荔赤眼蜂T.oleae，是完全感染Wolbachia的产雌孤雌生殖品系，该蜂为中国野外首次发现。5月为中国华南地区荔枝蒂蛀虫的高发季，荔枝分泌出的芳香烃会吸引荔枝蒂蛀虫雌虫产卵(Mengetal., 2018)，可能会导致安荔赤眼蜂种群数量的升高。10月份再次在华南农业大学树木园内采集到了安荔赤眼蜂，而此时安荔赤眼蜂的寄主种类尚需进一步确认。

在过去的研究中，赤眼蜂的鉴定依据主要是雄虫的形态特征(Nagaraja and Nagarkatti, 1969; Nagarkatti and Nagaraja, 1977)，以及ITS2序列(Stouthameretal., 1999)。不同的分子标记技术都有自己的缺点，例如，ITS2不能区分微小赤眼蜂T.minutum和T.plantneri(Stouthameretal., 1999)。因此只通过一种分子鉴定方法得到的结果往往是不准确的，但先通过解剖赤眼蜂的雄性外生殖器进行形态鉴定之后，再进行ITS2序列的分子比对，将形态鉴定与分子鉴定结合起来可以得到可靠的结果(Polaszeketal., 2011)。

安荔赤眼蜂分布于前南斯拉夫、意大利、保加利亚、希腊及法国，寄主为橄榄树上的绢螟属Diaphania(Glyphodes)unionalesHB及菜蛾科橄榄蛾PraysoleaeBernard(Voegelé and Pointel，1979)。在国外，Gharbi等(2014)探究了冷藏期和饲养温度对安荔赤眼蜂的生物学影响，表明该赤眼蜂具有耐低温的能力。安荔赤眼蜂通常被用于橄榄树上的害虫防治(Ksentinietal., 2011)，随着雌蜂日龄的增长，安荔赤眼蜂可倾向于接受更多变质的卵(Ksentinietal., 2018)；中国曾赞安等(2007)从室内的18个赤眼蜂蜂种中发现只有食胚赤眼蜂Trichogrammaembryophagum和安荔赤眼蜂对荔枝蒂蛀虫卵有寄生能力，其余16种赤眼蜂并未发现能寄生荔枝蒂蛀虫，其中安荔赤眼蜂的寄生率为29.00%，子代羽化率为80.49%。这些生物学特征说明该赤眼蜂在田间释放可以很快适应野外环境，具有很强的种群定殖能力，在生物防治上具有一定的应用前景。

李菁等(2018)基于wsp序列及MLST等位基因谱系统发育分析表明wOfur2株系与其他昆虫宿主中具有杀雄和诱导胞质不亲和作用的Wolbachia株系具有很近的亲缘关系。国内外都未对安荔赤眼蜂体内的Wolbachia进行MLST分析，本研究通过对野外采集的安荔赤眼蜂进行了体内Wolbachia的检测，结果表明采集到的安荔赤眼蜂Wolbachia感染率达到了100%。本研究中基于wsp基因分析显示，安荔赤眼蜂体内的Wolbachia属于B超组中的Sib亚组，与GenBank上下载的安荔赤眼蜂(前南斯拉夫品系)、短管赤眼蜂(乌拉圭品系)以及T.deion(荷兰品系)体内Wolbachia亲缘关系较近(图4)，这一结果与MLST分析结果(图5)一致，表明wSib株系与wDei株系为两个亲缘关系很近的亚组。但由于Wolbachia数据库中寄主为Trichogramma的数据较少，所采集到安荔赤眼蜂同其他赤眼蜂体内的Wolbachia之间是否存在水平传播的现象还需进一步研究。MLST基因存在重组的现象，重组率低导致一般的系统发育研究难以体现差异(Lefoulonetal., 2017)，Bleidorn和Gerth(2018)建议使用Wolbachia的基因组来作为Wolbachia分类及系统发育研究，这为进一步研究亲缘关系较近的Wolbachia亚群提供了研究方向。