黄连中药根碱分别联合阿米卡星与头孢哌酮/舒巴坦对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抑菌作用*

李 莹，施 瑜，段秀杰，周银霞

1.镇江市中西医结合医院检验科，江苏镇江 212001；2.江苏大学附属医院检验科，江苏镇江 212031；3.镇江市中西医结合医院药械科，江苏镇江 212001

近年来，因广谱抗菌药物的大量使用，耐多药的鲍曼不动杆菌菌株不断出现，且有在全球范围内流行的趋势，广泛耐药株的检出率也逐渐升高[1-2]。临床医生越来越多地依赖碳青霉烯类药物针对耐药革兰阴性杆菌引起的感染进行靶向治疗，但耐药革兰阴性杆菌对碳青霉烯的耐药率正在增加，特别是克雷伯菌和鲍曼不动杆菌[3-5]。目前，泛耐药鲍曼不动杆菌是引起院内肺炎的主要病原体之一，可导致菌血症和败血症等并发症[6]。能治疗泛耐药鲍曼不动杆菌感染的抗菌药物数量有限，仅包括多黏菌素和替加环素。然而，多黏菌素的功效受肾毒性和耐黏菌素的菌株限制，此外，替加环素的临床疗效仍存在争议。因此，临床上对泛耐药鲍曼不动杆菌感染常采用两药、三药联合治疗[7-8]。黄连中药根碱为中药制剂，具有辛凉解表、清热解毒、抗菌等作用，而阿米卡星和头孢哌酮/舒巴坦均为临床治疗鲍曼不动杆菌常用抗菌药物[9-10]。本研究拟探讨黄连中药根碱分别联合阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦2种不同抗菌药物的抑菌作用，为临床合理用药及中西药联合抑菌机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源 标本来自2018年9月至2019年9月镇江市中西医结合医院及江苏大学附属医院分离的25株鲍曼不动杆菌，质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。

1.1.2仪器与试剂 M-H琼脂培养基、M-H肉汤培养基、麦康凯选择平板、血平板(上海科玛嘉微生物技术有限公司，批号分别为SH103567、SH113529、HK1005、HK1010)；微生物鉴定药敏板(珠海迪尔生物工程有限公司，批号108839)；DL-96Ⅱ型半自动微生物鉴定及药敏分析仪、SCAN-10型自动加样仪、DL-ZD3型数字式浊度计(珠海迪尔生物工程有限公司)；HR40-ⅡA2型生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；赛默飞3111型二氧化碳培养箱(美国赛默飞科技公司)；BSA224S-CW型电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.1.3试验药物 黄连中药根碱(黄连提取物包括14.45%的盐酸药根碱和60.24%的盐酸小檗碱。哈药集团中药二厂，批号20190716)；盐酸药根碱对照品、盐酸小檗碱对照品(批号0756-201504、110317-201208，均购自中国药品生物制品检定所)；硫酸阿米卡星注射液(辽宁新高制药有限公司，国药准字H21024269，规格2 mL∶0.2 g，批号20190811)；注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶1,珠海金鸿药业股份有限公司，国药准字H20066374，规格1 g，包括头孢哌酮0.5 g与舒巴坦0.5 g，批号190527)。

1.2方法

1.2.1分离与鉴定

1.2.1.1分离培养 痰液标本以平板划线法接种于麦康凯选择培养基和血琼脂培养基做分离培养，35 ℃培养18～24 h后观察菌落形态，鲍曼不动杆菌的菌落光滑、边缘整齐，呈灰白色、圆形，直径2～3 mm。挑取鲍曼不动杆菌可疑菌落，涂片进行革兰染色，并再次接种于血琼脂培养基做分离培养，35 ℃培养18～24 h。

1.2.1.2菌落鉴定 标本分纯培养后，采用DL-96Ⅱ型半自动微生物鉴定仪和药敏分析系统按照CLSIM100-S26原则进行鉴定和药敏试验，25株鲍曼不动杆菌均为泛耐药鲍曼不动杆菌，该菌株对头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、美洛培南、亚胺培南、米诺环素、庆大霉素、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑全部耐药。

1.2.2试验方法

1.2.2.1菌液制备 将临床分离的25株泛耐药鲍曼不动杆菌菌落接种于M-H平板，37 ℃培养过夜，次日挑取单菌落用M-H肉汤培养4～6 h，收集细菌溶于0.9%NaCl注射液并用比浊仪校正浓度至0.5麦氏单位(约1×108CFU/mL)，再用M-H肉汤稀释10倍备用。

1.2.2.2最低抑菌浓度(MIC)测定 参照美国临床实验室标准化协会推荐的微量肉汤稀释法测定黄连中药根碱、阿米卡星及头孢哌酮/舒巴坦的MIC。以200.00 mg/mL黄连中药根碱、512 μg/mL头孢哌酮/舒巴坦、1 024 μg/mL阿米卡星作为药物原液，用M-H肉汤配制成系列浓度：黄连中药根碱1.56～100.00 mg/mL、头孢哌酮/舒巴坦4～256 μg/mL、阿米卡星8～512 μg/mL。将各浓度药液加入25组试管中，除第1管外，每管加入M-H肉汤培养基1.0 mL，然后将待测菌依次加入含药管内并混匀，每管50 μL，同时做空白和阳性对照，35 ℃培养12～18 h，观察结果，测定25株泛耐药鲍曼不动杆菌对黄连中药根碱、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦的MIC。MIC范围为抑制细菌生长所需药物的最低浓度范围；MIC50为使累计50%的菌株受抑的MIC值；MIC90为使累计90%的菌株受抑的MIC值。

1.2.2.3联合抑菌试验 以MIC的2倍作为最高浓度，依次对黄连中药根碱、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦进行对倍稀释，每种药物10个稀释浓度，按棋盘设计法分别将不同浓度的黄连中药根碱、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦两两组合加入试管中，每种药物各0.5 mL，轻微振荡混匀，35 ℃培养12～18 h 后观察结果。选择最佳组合效应时2种药物联用时各自的MIC，以及单独用药时的MIC，记录并计算分级抑菌浓度(FIC)指数。FIC指数=黄连中药根碱联合的MIC/单独的MIC+阿米卡星或头孢哌酮/舒巴坦联合的MIC/单独的MIC。FIC指数≤0.5为协同作用，FIC指数>0.5～1.0为相加作用，FIC指数>1.0～2.0为无关作用，FIC指数>2.0为拮抗作用。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行整理分析，计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1单独及联合用药的MIC及范围 黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦的MIC均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。黄连中药根碱分别联合阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦后，其MIC范围与3药单独相比保持不变或有所降低，而黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦降低最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、3。

表1 25株鲍曼不动杆菌中黄连中药根碱、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦单独及联合用药的MIC

表2 黄连中药根碱、阿米卡星单独及联合用药的MIC范围

表3 黄连中药根碱、头孢哌酮/舒巴坦单独及联合用药的MIC范围

2.2单独及联合用药的MIC分布情况 单独用药时，随着药物浓度的升高，广泛耐药鲍曼不动杆菌在使用黄连中药根碱、阿米卡星后的阳性菌株比例先升后降，使用头孢哌酮/舒巴坦后阳性菌株比例持续升高。黄连中药根碱与阿米卡星，黄连中药根碱与头孢哌酮/舒巴坦联合用药后，阳性菌株比例总体上随着药物浓度升高而降低。见表4、5。

表4 黄连中药根碱、阿米卡星单独及联合用药的MIC与阳性菌株分布

2.3相同累计抑菌率时单独及联合用药浓度的药物浓度 在累计抑菌率相同时，联合用药的药物浓度较单独用药时低，其中黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦浓度降低最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表5 黄连中药根碱、头孢哌酮/舒巴坦单独及联合用药的MIC与阳性菌株分布

表6 相同累计抑菌率时黄连中药根碱、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦单独及联合用药的药物浓度

2.4联合用药时不同FIC指数的占比 黄连中药根碱联合阿米卡星联合用药FIC指数为1.0～<2.0时占比为72%，以无关作用为主；黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦用药FIC指数为0.5～<1.0时占比为72%，以相加作用为主。见表7。

表7 黄连中药根碱分别联合阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦用药的不同FIC指数占比[n(%)]

3 讨 论

鲍曼不动杆菌耐药现象呈逐年上升趋势，其对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等抗菌药物均有一定的耐药性，给临床抗菌治疗带来巨大挑战[11-12]。对潜在抗菌药物进行的一项关于植物源性物质的活性研究表明，天然植物的活性化合物可能成为未来新药的来源[13]。一些从草药中提取的活性化合物显示出对鲍曼不动杆菌和其他革兰阴性菌具有潜在活性。有研究报道，从草药提取物中鉴定出的6种最活跃的化合物之一为来自黄芩的黄芩苷，几种清热解毒的中草药通过不同的作用机制均具有抗炎和抗菌作用[14]。鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识建议，耐药鲍曼不动杆菌的治疗主张联合用药[15]。有研究显示，黄连主要含有多糖、挥发油、有机酸、甾体、萜类、黄酮、香豆素、木脂素、异喹啉类生物碱等多种化学成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、降血糖、抗肿瘤、调血脂、抗心律失常等药理活性，其与抗菌药物联合用药已成为新的探索方向[16]。

帅丽华等[17]研究显示，黄连提取物与左氧氟沙星联合用药后对大部分耐药菌(90.9%)均表现为协同或相加作用。吴东美等[18]研究显示，抗菌药物、消毒剂(氯己定)和抗菌中药(黄连)均能诱导细菌产生交叉耐药，细菌对三者的抑菌机制可能相同。本研究结果显示，黄连中药根碱分别联合阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦用药的MIC分布浓度较单独用药有所降低，尤其黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦用药的MIC分布浓度较单独用药降低最为明显，表明黄连中药根碱与头孢哌酮/舒巴坦联合用药效果较好。在累计抑菌率相同时，联合用药的药物浓度较单独用药时低，其中黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦药物浓度降低最为明显，表明在相对较低浓度时黄连中药根碱与头孢哌酮/舒巴坦可以取得同等的抑菌效果，其可以减轻患者的抗菌药物负担。本研究结果显示，黄连中药根碱联合阿米卡星用药16%为相加作用，72%为无关作用，12%为拮抗作用，表明黄连中药根碱与阿米卡星对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外联合抑菌作用较弱。而黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦用药24%为协同作用，72%为相加作用，4%为无关作用，表明黄连中药根碱与头孢哌酮/舒巴坦联合对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外联合抑菌作用较好。有研究显示，双黄连联合米诺环素和哌拉西林/他唑巴坦对广泛耐药鲍曼不动杆菌多数表现为无关作用和拮抗作用，体外联合抑菌作用较差；而双黄连联合头孢哌酮/舒巴坦的体外抑菌作用较好[19]。研究还显示，头孢哌酮/舒巴坦具有明显的抗菌活性[20]。以上研究均都与本研究结果相一致，机制可能与干扰细菌核酸、蛋白等组分合成、抑制细菌的外排泵等因素有关。

综上所述，黄连中药根碱联合头孢哌酮/舒巴坦增强了单独用药(头孢哌酮/舒巴坦)的抑菌效果，通过减少头孢哌酮/舒巴坦的用量可以延缓细菌耐药，其体内抑菌效果及具体耐药机制仍有待进一步深入研究。