miR-152通过调控FOXR2表达抑制人前列腺癌细胞增殖的研究

李阳波，李 健，贾志刚，许亚宏，刘 琼，莫 非，李弋戈

西部战区空军医院泌尿外科，四川成都 610021

前列腺癌是男性最为常见的恶性肿瘤之一，也是全球男性癌症患者的主要死因。随着人口老龄化程度加深，前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势，而前列腺癌的发病机制至今未明[1]。微小RNA(miRNA)是哺乳动物体内广泛存在的一种内源性调节性保守的非编码RNA(ncRNA)，其大小为18～25 nt，可以通过转录后调控模式调控靶基因的表达[2]。ncRNA可通过多种途径影响转化生长因子β、表皮生长因子和肿瘤坏死因子的表达，参与前列腺癌的发生、发展[3-4]。有研究指出，miR-200家族(miR-200a/b、miR-141和miR-429)可通过靶向调控Zeb2抑制前列腺癌的侵袭和转移，上调下游靶基因的表达从而抑制前列腺癌的进程[5]。此外，miR-410-3p可作用于磷酸酶及张力蛋白同源基因，调控AKT/mTOR信号通路，在前列腺癌发展过程中发挥促进作用[6]；miR-141-3p可通过激活核因子-κB信号通路促进前列腺癌的远端转移[7]。研究发现，前列腺癌组织中miR-152的相对表达水平显著低于正常癌旁组织，随着肿瘤恶性程度的升高，前列腺癌组织中miR-152的相对表达水平越低[8]。生物信息学法预测叉头框蛋白R2(FOXR2)可能为miR-152的直接靶基因。因此，本文研究miR-152和FOXR2之间的调控作用，并探讨二者对前列腺癌细胞增殖的影响，为前列腺癌的发生机制提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株来源 人前列腺癌细胞株PC-3(前列腺癌细胞组)和前列腺上皮细胞株RWPE-1(对照组)购自美国标准菌库(ATCC)。

1.1.2细胞培养 PC-3和RWPE-1细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，37 ℃ 5% CO2，待细胞生长至70%～80%时，0.25%胰酶消化后以1∶3传代。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。Trizol试剂、lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。RIPA裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂、BCA蛋白检测试剂盒、蛋白上样缓冲液购自中国碧云天公司。FOXR2抗体和GAPDH内参抗体购自英国Abcam公司，引物由上海恒斐公司合成，TaqMan®Universal PCR Master Mix、TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription Kit购自美国ABI公司，miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和FOXR2-siRNA由上海吉玛公司合成。双荧光素酶检测试剂盒、pmir-GLO载体购自美国Promega公司。

1.2.2Western blot检测FOXR2蛋白水平 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白浓度检测后，加入蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶70 V转120 V电泳分离蛋白，250 mA转膜1.0 h，室温封闭1.5 h，FOXR2一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶5 000)室温孵育2.0 h，超敏发光液显色，胶片曝光后，以GAPDH为内参，使用Image软件计算FOXR2蛋白水平，实验重复5次。

1.2.3实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-152和FOXR2 mRNA的表达 Trizol试剂提取细胞总RNA后，将其进行反转录，然后使用美国Bio-rad公司的 CFX96 qPCR仪进行基因扩增，SYBR Green染料标记产物，以GAPDH为内参，根据荧光强度计算目的基因的相对表达水平，实验重复5次。

1.2.4细胞转染 6孔板中接种106个PC-3细胞，无血清饥饿培养24 h。将转染物(miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、FOXR2-siRNA)和lipofectamine 2000分别加入到等体积无血清培养基中，室温孵育5 min，然后将二者混匀后，继续室温孵育20 min，将混合液加入到已倾去培养基的6孔板中，培养箱中孵育6 h，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h，再进行检测。

1.2.5MTT法检测细胞活性 细胞转染后接种于96孔板，细胞培养箱中孵育48 h，每孔加入20 μL的 MTT溶液，4 h后弃去上清液，每孔加入200 μL的二甲基亚砜，37 ℃摇晃10 min后，490 nm处测定吸光度值(A490)，评价细胞活性，用以反映细胞增殖能力。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测 miRanda、NBmiRTar等数据库预测miR-152与FOXR2 3′ UTR可能的基因结合序列。将克隆的FOXR2 3′UTR区及其突变体分别插入到pmir-GLO载体，以此构建FOXR2 3′UTR野生型和突变型质粒。将miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和miR-152 scramble分别与融合FOXR2 3′UTR区及其突变体的质粒共转染PC-3细胞。转染结束后，培养箱中孵育48 h，弃去液体后加入裂解液，室温放置10 min，-80 ℃冻融1次，离心收集上清液，加入荧光素底物，充分混匀10 s后，检测荧光强度，再加入海参荧光素酶底物，混匀10 s后再次检测荧光素酶活性，计算相对荧光强度，实验重复5次。

2 结 果

2.1RWPE-1和PC-3细胞中miR-152、FOXR2 mRNA的相对表达水平及FOXR2蛋白水平 PC-3细胞中miR-152的相对表达水平为RWPE-1细胞的40.91%(P=0.001)；而PC-3细胞中FOXR2 蛋白水平及mRNA的相对表达水平分别为RWPE-1细胞中FOXR2 蛋白及mRNA的205.75%和167.61%(P=0.003、0.003)。见表1、图1。

表1 RWPE-1和PC-3细胞中miR-152和FOXR2 mRNA的相对表达水平及FOXR2蛋白水平

图1 RWPE-1和PC-3细胞中FOXR2蛋白表达的Western blot图

2.2miR-152和FOXR2对PC-3细胞增殖能力的影响 miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和FOXR2-siRNA分别转染PC-3细胞后，通过MTT法评价细胞增殖活性，以各组A490值为计算依据，对照组A490值为0.91±0.18，miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和FOXR2-siRNA组A490值的分别为0.66±0.88、1.18±0.14和0.59±0.06，该3组的细胞增殖效率与对照组相比，分别降低27.47%、升高29.67%和降低35.16%，差异均有统计学意义(P=0.022、0.029、0.006)。

2.3miR-152对PC-3细胞FOXR2 3′UTR区的影响 分别共转染miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、miR-152 scramble和FOXR2 3′UTR突变型质粒后，荧光素酶活性均无显著变化(P=0.542)。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、miR-152 scramble分别与FOXR2 3′UTR野生型质粒共转染PC-3细胞后，荧光素酶活性分别显著降低、升高、无显著变化(P=0.001、0.001、0.428)。

2.4转染miR-152对PC-3细胞中FOXR2 mRNA相对表达水平及蛋白水平的影响 与对照组比较，转染miR-152 mimics后，miR-152 mRNA的相对表达水平升高10倍以上(P<0.001)，而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平分别降低42.40%和29.73%(P<0.001、0.001)，细胞活性降低28.74%(P=0.013)。转染miR-152 inhibitor后，miR-152的相对表达水平下降18.64%(P<0.001)，而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平上升61.60%和54.05%(P<0.001、P=0.007)，细胞活性增加37.93%(P=0.018)。见表2、图2。

表2 转染miR-152对PC-3细胞中FOXR2 mRNA相对表达水平及蛋白水平的影响

注：A表示转染miR-152 mimics对FOXR2蛋白的影响；B表示转染miR-152 inhibitor对FOXR2蛋白的影响。

3 讨 论

前列腺癌是一种男性泌尿生殖系统恶性肿瘤，全球发病率较高，且缺乏公认的治疗方法[9]。随着分子生物学的快速发展，以miRNA为靶标治疗肿瘤成为研究热点，miRNA通过结合靶基因3′UTR区在转录后水平调控靶基因的表达，与多种肿瘤的发生、发展、转移和预后等密切相关[10]。目前，已有多种miRNA被发现在前列腺癌患者血清或癌组织中异常表达，并且miRNA的相对表达水平与前列腺癌患者临床分级、化疗敏感性和骨转移等显著相关[11]。如miR-618可通过负调控FOXP2抑制前列腺癌的迁移和侵袭能力[12]；miR-199a-3p可通过靶向调控Smad1抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力[13]。miR-152在其他肿瘤细胞中的作用已有报道，如miR-152-3p在非小细胞肺癌中抑制肿瘤细胞增殖，在子宫内膜癌中抑制肿瘤细胞形成、转移和侵袭[14]。研究表明，前列腺癌细胞中miR-152启动子序列呈高度甲基化，而miR-152异位表达可抑制前列腺癌细胞的增殖、转移和侵袭，且miR-152的相对表达水平降低可导致肿瘤转移增加等不良临床结果[15]。

生物信息学软件预测结果表明，FOXR2可能为miR-152的直接靶基因。FOX属于保守的转录因子家族，能够调控细胞增殖、分化、生长等关键生物学过程，其表达异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关[16]。FOXR2是最新发现的一个致癌基因，可促进胶质瘤[17]、结直肠癌[18]、肝细胞癌[19]等多种肿瘤细胞增殖，成为治疗肿瘤的最新研究靶点。研究发现，FOXR2在前列腺癌细胞中过表达，降低FOXR2 mRNA的相对表达水平可显著抑制前列腺癌细胞增殖，有望成为治疗前列腺癌的新靶标[20]。

本研究结果表明，在PC-3细胞系中，miR-152的相对表达水平显著低于RWPE-1细胞系，而FOXR2 mRNA的相对表达水平及蛋白水平显著升高，表明miR-152和FOXR2对于前列腺癌的发生、发展具有重要作用。本研究结果显示，miR-152 mimics和FOXR2-siRNA分别转染PC-3细胞后，细胞增殖均显著降低，而miR-152 inhibitor转染PC-3细胞可使细胞增殖能力升高，该结果说明miR-152和FOXR2能够调控PC-3细胞增殖能力，甚至二者之间可能存在某些调控关系。生物信息学软件预测结果表明，FOXR2可能为miR-152的直接靶基因，而本研究双荧光素报告基因实验证实，miR-152可从基因水平直接负调控FOXR2基因表达。转染实验结果表明，转染miR-152 mimics后可下调FOXR2 mRNA的表达，继而抑制FOXR2蛋白翻译，降低FOXR2蛋白表达；转染miR-152 inhibitor可上调FOXR2 mRNA表达，最终增强FOXR2蛋白翻译能力，表明miR-152可通过直接负调控FOXR2基因转录，继而影响FOXR2蛋白翻译水平。以上结果提示可尝试通过增强前列腺癌细胞中miR-152基因表达，抑制FOXR2基因和蛋白表达，继而抑制细胞增殖，达到缓解前列腺癌的治疗目标。

综上所述，本研究发现上调miR-152表达能够抑制前列腺癌细胞增殖能力，该作用可能与其负调控FOXR2表达有关。