人微小病毒 B19荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

许良云,张其刚,范广来,赵建华

(1.南京医科大学第四临床医学院附属肿瘤医院,江苏 南京,210009; 2.江苏省淮安市妇幼保健院 基因检测技术应用示范中心,江苏 淮安,223002)

人微小病毒B19(HPV B19)属于微小病毒科、微小病毒亚科、红病毒属，最早于1975年被发现[1-3]。HPV B19呈二十面体，直径为22～24 nm,是一种无包膜的单链、线性DNA病毒。HPV B19感染可引起胎儿水肿、再生障碍性贫血、肾小球病等[4-5]多种疾病。HPV B19基因组有2个开放阅读框(ORF),左端ORF编码对宿主细胞有细胞毒性的结构蛋白NS1,该序列高度保守;右端ORF编码该病毒的结构蛋白VP1和VP2,VP1和VP2序列为高变区。

HPV B19以呼吸道传播为主，常在冬季和春季流行，流行病学爆发的周期一般为3～5年，但偶发病例可在全年发生[6]。HPV B19的检测方法主要为特异性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)血清学检测和定量聚合酶链式反应(PCR)病毒核酸检测。本研究基于NS1保守区序列，建立HPV B19的通用型荧光定量PCR检测方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验室检测样本为单纯疱疹病毒(HSV) 2型、巨细胞病毒(CMV)、B族链球菌(GBS)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV) 阳性DNA样本以及反复流产妇女外周血标本。

1.2 主要仪器和试剂

Probe qPCR Mix(TakaRa,Code No.RR391A);细菌基因组DNA提取试剂盒 (北京天根生化公司,Code No.DP305-02);StepOnePlus荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司);Qubit 3核酸/蛋白质定量荧光计(美国Thermo Fisher公司);生物安全柜等。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针的设计:通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库查询HPV B19 3类基因型代表性的5株序列(GenBank:M13178;AY582162;AY044266;NC_004295;AY582153),运用在线工具MAFFT(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)比对NS1区序列，选取保守区序列设计引物和探针。见表1。

表1 HPV B19实时荧光定量PCR检测的引物及探针

1.3.2 制备质粒:按照病毒株M13178的序列，由上海生工生物合成引物扩增区的寡核苷酸序列，将该片段插入到pUC57载体中获得HPV B19质粒，质粒全长为2912 bp。……