不同地方种群黄鳝暴露在亚硝酸钠环境中对其免疫、抗氧化和肌肉生长能力的影响

陈 强,吕巍巍,焦 阳,黄银盈,袁 泉,黄伟伟,孙小琳,周文宗,赵云龙

(1.华东师范大学 生命科学学院，上海 200241； 2.上海市农业科学院 生态环境研究所，上海 201403)

黄鳝(Monopterusalbus)属辐鳍鱼纲(Actinopterygii)、合鳃目(Synbranchiformes)、合鳃鱼科(Synbranchidae)、黄鳝属(Monopterus)，在东南亚到东亚各国均有分布.黄鳝肉质鲜嫩，味道鲜美，是人们经常食用的淡水鱼类之一.随着黄鳝的消费市场扩大，黄鳝的人工养殖产量不断增加，但人工养殖的问题也日益显现，作为种源黄鳝的遗传多样性的降低导致后代环境适应能力下降[1]，同时人工养殖群体也会逃逸到自然环境中，使野外群体的环境适应性降低[2-3].因此，加强种源建设，特别是优质种源的选育或研究十分必要.

亚硝酸盐是一种广泛存在于自然界水体中的含氮化合物，由需氧细菌和硝化过程有关的氨形成.在水体中，亚硝酸盐是对水生动物有害的物质之一.随着水产养殖产业的发展，高密度大规模集约化养殖模式的兴起，由循环水产养殖系统中硝化细菌活性的不平衡导致的水体中残余的饵料和高含氮排泄物浓度过高会造成养殖水体中亚硝酸盐浓度过高，有的可以达到50 mg/L以上[4].而自然水体中，某些水体的亚硝酸盐浓度也可以达到0.5 mg/L[5]，在一些跨越农业区域的夏季地表水体中，亚硝酸盐浓度高达1 mg/L以上[6].亚硝酸盐水平升高是触发压力反应的潜在因素，甚至可能对水生生物的生存构成重大威胁.

当暴露在一定浓度的亚硝酸盐环境中，水生动物生理状态会出现多方面的变化.有研究表明高浓度的亚硝酸盐会抑制免疫功能并改变免疫相关的酶活性[7]，导致氧化应激，氧化应激是亚硝酸盐的毒性机制之一[8].通常情况下生物体有一套完善的调节机制，通过抗氧化酶系统可防止氧化应激.在正常的生理状态下，活性氧(ROS)被超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等快速消除[9].同时，氧化应激也可能与炎症反应的激活有关.炎症是免疫反应的重要组成部分，主要是由细胞因子介导的[10].响应亚硝酸盐的促炎细胞因子水平升高，可能反映了亚硝酸钠增强细胞过氧化损伤的能力.在压力条件下，热激蛋白(HSP)充当分子伴侣来调节蛋白质稳态，防止蛋白质聚集并协助错误折叠的蛋白重新折叠.据报道，热休克蛋白的表达是由环境压力诱导的，包括热应激[11]、病原体感染[12]、重金属暴露[13]和亚硝酸盐暴露[9].黄鳝作为形态特异化的淡水鱼类，鳃退化后仅靠皮肤、肠等进行呼吸作用，高密度养殖过程中产生的亚硝酸盐对其的影响目前尚不清楚.

本文报道不同地方种群的黄鳝在暴露于亚硝酸盐水体中体内非特异性免疫能力与抗氧化能力的变化，检测了肌肉中生肌调节因子相关的基因表达，以此来评估不同地方种群的黄鳝在应对亚硝酸盐的适应能力，为人工选育抗压性强的黄鳝品系提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 实验动物养殖

从中国五大湖即鄱阳湖(PYH)、洞庭湖(DTH)、洪泽湖(HZH)、太湖(TH)和巢湖(CH)使用地笼和鳝笼进行捕捉，傍晚将其放入湖边水草茂盛处，第2天早上将捕捉到的黄鳝放入暂养箱，使用充气泵进行持续供氧，每个群体捕捉到50条后，通过汽车将活体运输到华东师范大学生物站进行为期2周的驯养.实验开始时，各个群体选择规格接近，平均体重约为(15.57±1.56)g的个体，每个群体有4个平行塑料缸，每个塑料缸内随机放入9条黄鳝，使用黑色塑料袋和小型鳝巢作为遮蔽物.

在自然水体中亚硝酸盐的浓度往往可达到1 mg/L左右[14]，因此本文选择使用1 mg/L 的亚硝酸盐浓度进行21天暴露.养殖用水为除氯曝气3天以上的自来水，每个塑料缸加入20 L配置好的1 mg/L的亚硝酸钠溶液.每天傍晚6点饱食投喂，食物为蚯蚓与商业饲料的混合物，于第2天早上8点清除残饵和死亡个体，并重新补足配置好的1 mg/L亚硝酸钠溶液.在21天的养殖期间持续充氧，溶解氧浓度大于6.5 mg/L，水温维持在(27±1)℃，pH 7.0±0.3.

1.2 样品采集

每7天取样一次，每组随机取3条黄鳝.取样前饥饿处理24 h，用MS-222麻醉.使用2.5 mL一次性塑料针头抽取1 mL血淋巴，加入1 mL抗凝剂，4 ℃低温高速离心机3 800 r/min转下离心15 min，分离血浆与血细胞，放入-80 ℃超低温冰箱储存待测.将黄鳝置于冰浴中，用无菌镊子和剪刀完整剪出肝和肌肉，将组织置于离心管中，液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱.

1.3 生化分析

测定肝组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、脂质过氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)等氧化还原酶和氧化应激指标，采用苏州科铭相关试剂盒进行测定.样品可溶性蛋白浓度采用考马斯亮蓝法(苏州科铭)进行测定.

1.4 基因表达

使用高通量组织研磨仪将第21天的肝和肌肉组织磨碎成悬液，使用TRIzol试剂提取总RNA，用凝胶电泳检测总RNA质量，并用NanoDrop分光光度计测量总RNA浓度和OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0最佳.使用带有去基因组成分的NovoScript 1stStrand cDNA Synthesis试剂盒(Novoprotein)合成cDNA.使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒进行定量PCR反应，定量PCR检测平台为BIO-RAD CFX96TM实时系统.基因特异性引物如表1所示，使用RPL17作为内参基因.

表1 qPCR过程中使用的引物序列

1.5 数据统计与分析

使用SPSS 21.0软件分析数据，所有数据均表示为平均值±标准误差，使用单因素方差分析(ANOVA)，进行Duncan’s检验评估显著关系,差异显著表示为P<0.05.整个实验以年产量最高的江西省鄱阳湖(PYH)群体为对照组.

2 结 果

2.1 亚硝酸盐对黄鳝抗氧化系统的影响

2.1.1 对肝脏组织抗氧化酶活性和抗氧化物质的影响

肝脏中抗氧化酶酶活和抗氧化物质含量如图1所示.在暴露7 d后，PYH群体的SOD活性显著高于其他群体(P<0.05)，而在暴露21 d后，各群体间无显著差异(P>0.05).各群体的CAT活性除暴露14 d后的HZH群体外，其余群体在整个暴露实验中都无显著差异(P>0.05).PYH、CH和TH群体的GSH含量表现出先上升后下降的趋势.PYH、CH群体的GSSG含量表现出随时间的增加而持续下降，TH和DTH群体表现出先下降后上升的趋势，HZH群体表现为先上升后下降的趋势.

图1 在暴露21天过程中各野生黄鳝群体肝脏中抗氧化酶活性及抗氧化物质含量Fig.1 Antioxidant enzyme activity and antioxidant substance content in the liver of each wild rice eel population during 21 days of exposure

2.1.2 对肝脏组织氧化应激标志含量的影响

组织氧化应激标志LPO和MDA水平变化如图2所示.PYH群体的LPO呈时间依赖性下降，CH、TH、DTH群体呈先下降后上升的趋势，在暴露21 d后，PYH群体的LPO含量显著低于其他群体(P<0.05).PYH群体的MDA含量也呈时间依赖性下降，在暴露7 d和14 d时，除PYH群体外，其他群体间无显著差异(P>0.05)，在暴露21 d后，各群体间无显著差异(P>0.05).

图2 在暴露21天过程中各野生黄鳝群体肝脏中氧化应激标志的含量Fig.2 The content of oxidative stress markers in the liver of each wild rice eel population during 21 days after exposure

2.2 亚硝酸盐对黄鳝肝脏组织免疫相关基因表达的影响

在暴露21 d后，特异性免疫能力相关基因MHC-2A和非特异性免疫能力抗菌肽相关基因Hepcidin在肝组织中表达结果如图3所示.与PYH相比，其他群体MHC-2A表达量显著下降(P<0.05)，而且除TH与HZH之间无显著差异外(P>0.05)，各群体间存在显著差异(P<0.05).Hepcidin的表达中，仅TH群体显著高于PYH群体(P<0.05)，其余群体均显著低于PYH群体(P<0.05).综合来看，PYH群体和DTH群体的非特异性免疫能力在暴露于亚硝酸盐后仍维持较高水平.

图3 暴露21天后各野生黄鳝群体肝脏中免疫相关基因表达Fig.3 Expression of immune-related genes in the liver of each wild rice eel population after 21 days exposure

2.3 亚硝酸盐对黄鳝肝脏组织炎症相关基因表达的影响

在暴露21 d后，肝脏组织中炎症相关的基因表达结果如图4所示.与PYH群体相比，DTH群体的COX-1、5-PO和HSP的表达都显著上升(P<0.05)，而DTH群体的COX-2表达与PYH群体无显著差异(P>0.05).CH除COX-2显著下降外(P<0.05)，其余基因表达与PYH群体无显著差异(P>0.05).TH的COX-2和5-PO的表达均显著高于PYH(P<0.05)，HSP与COX-1则显著低于PYH(P<0.05).HZH与PYH相比，COX-1无显著差异(P>0.05)，其余基因表达则显著下降(P<0.05).

图4 暴露21天后各野生黄鳝群体肝脏中炎症相关基因的表达Fig.4 Expression of inflammation-related genes in the liver of each wild rice eel population after 21 days exposure

2.4 亚硝酸盐对黄鳝肌肉生肌调节因子相关基因表达的影响

各群体肌肉中的生肌调节因子相关基因的表达结果如图5所示.MYF5与MYOD1具有相似的变化趋势，即CH、TH和HZH群体显著高于PYH群体(P<0.05)，DTH群体与PYH群体在MYF5的表达上无显著差异(P>0.05)，但在MYOD1表达时DTH群体显著高于PYH群体(P<0.05).MRF4和MYOG的变化趋势也较为一致，CH、TH、DTH和HZH群体都显著高于PYH群体(P<0.05)，而各群体间的表达也存在差异(P<0.05).

图5 暴露21天后各野生黄鳝群体肌肉中生肌调节因子相关的基因表达Fig.5 Gene expression of myogenic regulatory factors in the muscles of wild rice field eel populations after 21 days exposure

3 讨 论

3.1 不同地方种群黄鳝免疫能力的比较

环境因子使鱼类的免疫能力发生变化已经被证明[17]，而亚硝酸盐水平升高是触发胁迫反应的潜在因素，可能对水生生物的生存构成重大威胁.Hepcidin是一种在肝脏合成的抗菌多肽[18]，在水生动物非特异性免疫中起重要作用，能够直接抑制病原微生物.主要组织相容性复合体MHC-2A属于体液免疫中的重要分子，在鱼类激活机体免疫应答中具有重要作用[19].本文的结果表明在亚硝酸盐暴露后，非特异性免疫相关基因Hepcidin和体液免疫相关基因MHC-2A在变化上基本一致，而PYH群体和DTH群体的免疫能力相对更高，在逆环境中能够更好地抵抗病原微生物的侵袭.亚硝酸盐浓度的变化会导致水生动物的免疫功能发生变化，这表明水生动物具有一定的低浓度亚硝酸盐适应能力，但高浓度会导致免疫损伤[20].本文结果证明不同地理群体的黄鳝在免疫能力上具有差异性，与在中华鳖、红鲤和团头鲂中的研究发现一致[21-23].

在众多炎症介质中，COX和5-LO被认为是参与炎症反应的重要分子，而HSP在氧化应激和炎症中被诱导产生并维护细胞的正常功能.本文的结果中COX与5-PO表达的升高表明机体可能面临较为严重的炎症反应，而HSP在各群体中则与前两者变化较为一致，因为HSP是一个对亚硝酸盐胁迫敏感的基因，会参与应对炎症反应并调节适应性反应[24].这在相关的文献中已证实，亚硝酸盐暴露后破坏鱼的抗氧化系统会诱导HSP表达，同时缺氧应激会上调动物组织中的HSP水平[25].所以HSP的表达是炎症与亚硝酸盐共同导致的结果.综合来看，TH和DTH群体可能面临更为严重的炎症反应，而PYH、CH和HZH群体则面临较轻微的炎症反应.

3.2 不同地方种群黄鳝抗氧化能力的比较

由于长期暴露于环境污染物，水生生物通常会遭受持续的氧化应激.SOD是一种特异性清除超氧化物自由基并生成H2O2的胞质酶.在本研究中，应对1 mg/L的亚硝酸钠的暴露时，黄鳝体内的氧化应激体系能够正常工作，但随着暴露时间的延长，SOD酶的活性下降，表明H2O2形成可能减少，也可能是SOD酶活性被环境中的亚硝酸盐抑制[26].CAT是主要的抗氧化系统成分，主要起到催化H2O2分解为H2O，能缓解源自SOD活性的H2O2中毒.肝脏中的CAT活性与SOD活性变化一致，是因为相比于SOD在氧化应激前期开始起作用，CAT具有滞后性，主要在在亚硝酸盐胁迫的后期发挥作用[9].GSH与GSSG是细胞内最重要的氧化还原对之一，对于清除细胞中的自由基具有重要作用.鱼类体内主要由谷胱甘肽还原酶调控GSSG转变为GSH，但在亚硝酸盐胁迫下，谷胱甘肽还原酶表达和活性会显著升高以响应氧化应激[27].在正常情况下，GSH浓度高于GSSG，但当遭遇过量氧化应激状态时，GSSG浓度会高于GSH[27].本文的结果也表明肝脏GSSG浓度都高于GSH浓度，进一步证明了各群体黄鳝处于氧化应激状态.

LPO是氧化应激条件下导致细胞功能丧失的主要因子，可能导致脂质膜完整性的丧失和有毒醛的产生.丙二醛(MDA)是过氧化脂质的分解产物之一，被广泛用作脂质过氧化的标志物，其升高的水平可以反映肝脏对脂质过氧化损伤的程度,这两种物质可以清楚地反映组织受氧化应激损害的程度.亚硝酸盐会诱导体内的ROS过量产生[8]，从而破坏抗氧化系统的正常功能，结果表明LPO与MDA含量在暴露7 d和14 d时，各群体具有一致性的变化趋势，表明抗氧化系统在黄鳝体内的维持，但在21 d时逐渐下降，表明亚硝酸盐诱导ROS过量产生后，抗氧化系统已经逐渐修复体内的氧化损伤，这也提示黄鳝可以较好地适应1 mg/L的亚硝酸盐压力.综合抗氧化系统表现与脂质过氧化物的产物含量评估，可以发现在早期暴露中PYH群体和CH群体在抗氧化能力上较强.

3.3 不同地方种群黄鳝肌肉分化生长能力的比较

黄鳝生肌调节因子(MRFs)家族包括MYF5、MYOD1、MYOD2、MYOG和MRF4，在肌肉细胞的增殖和分化过程中发挥关键作用.鱼类生肌调节因子可以分为两大类，第一大类(MYF5和MYOD)为生肌决定因子，促使肌肉前体细胞分化成肌细胞；第二大类(MYOG和MRF4)为生肌调节因子，主要促进成肌细胞转向终末骨骼肌肌纤维[28].在黄鳝体重14～27 g的阶段，MYF5和MYOD1高表达，而MRF4和MYOG较为稳定地低表达[29].这与本文选用(15.57±1.56) g的幼鳝结果较为一致，表明在幼鱼成长为成鱼的过程中，以肌纤维的增粗为主，主要是由MYOD和MYF5调控[30].值得注意地是，亚硝酸盐会增加肌肉前体细胞的增殖和代谢活性[31]，但尚不清楚是否会对黄鳝产生同样的效果.而在不同的群体当中，发现PYH群体的肌肉生长调控相比其他群体显著不足，而CH群体在面临环境压力时具有更好的肌肉生长分化能力.

本文利用同一浓度的亚硝酸钠暴露不同地方群体的黄鳝，通过检测肝脏免疫能力和炎症因子的基因表达水平，肝脏抗氧化系统中的相关指标和肌肉调节因子的水平，发现不同地方种群的黄鳝在面对亚硝酸盐暴露时，PYH群体和DTH群体的免疫能力相对较高，在逆环境中能够更好的抵抗病原微生物的侵袭；PYH、CH和HZH群体则具有较低的炎症反应；在早期暴露中PYH群体和CH群体在抗氧化能力上较强；CH群体相对在面临环境压力时具有更好的肌肉生长分化能力.本文证明了不同地理群体的黄鳝在面对同一环境时生理功能存在差异，可为黄鳝的人工选育提供基础资料.