lncRNA CASC19通过miR-152-3p上调HMGA2影响骨肉瘤发生发展的机制研究

符泰胜 刘春勇

骨肉瘤是一种原发的骨恶性肿瘤，其恶性程度高、转移早、预后差，靶向治疗是可直接靶向特定位点提高肿瘤局部治疗效果，同时减少对健康组织的毒性反应，部分靶向药物在骨肉瘤的临床应用中已经取得一定疗效，寻找开发更多的靶点和靶向药物对骨肉瘤的靶向治疗具有重要意义[1,2]。研究表明，lncRNA对miRNA具有海绵吸附作用，可作为一种竞争性的内源性RNA与miRNA相互作用，共同参与靶向基因的调控，从而参与肿瘤发生发展过程[3]。癌症易感基因19(cancer susceptibility 19，CASC19)是一种lncRNA，结直肠癌组织中CASC19高表达，其与肿瘤的大小、淋巴结转移及远处转移显著相关[4]。CASC19过表达通过靶向miR-140-5p上调细胞迁移诱导透明质酸酶1(cell migration inducing hyaluronidase 1，CEMIP)增强了结直肠癌细胞的侵袭，迁移和增殖[5]。研究发现，骨肉瘤组织中miR-152低表达，与Enneking分期、转移相关，是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素[6]。miR-152-3p通过靶向调控转录因子4(transcription factor 4，TCF4)抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导细胞凋亡[7]。LINC00174通过使miR-1523-3p海绵化并增加溶质载体家族2促葡萄糖转运蛋白成员1(solute carrier family 2/facilitated glucose transporter,member 1，SLC2A1)表达促进神经胶质瘤的癌变[8]。研究报道miR-490-3p通过靶向高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein AT-hook2，HMGA2)能显著抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡[9]。miR-106a-5p上调可通过靶向骨肉瘤细胞中的HMGA2抑制细胞增殖，迁移和侵袭[10]。然而CASC19对骨肉瘤发生发展的应收及其机制尚不清楚，本实验旨在研究CASC19是否通过调控miR-1523-3p/HMGA2影响骨肉瘤的发生发展。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 人成骨细胞hFOB 1.19和骨肉瘤细胞Saos2、U2OS、HOS购自美国ATCC；胎牛血清、DMEM-F12培养基、RPMI-1640培养基均购自美国Gibco公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自美国Progema公司；载体质粒购自上海吉玛制药技术有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒购自北京Solarbio公司；蛋白提取试剂盒、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)试剂盒购自美国Bio-Rad公司；抗体均购于美国Abcam公司；荧光素酶报告基因试剂盒和报告基因载体均购自美国Promega公司；Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；FACSCanto II流式细胞仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养与转染 人成骨细胞hFOB 1.19置于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液中，骨肉瘤细胞Saos2、U2OS、HOS置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞Saos2，消化后接种于6孔板内，培养24 h后按照LipofectamineTM2000试剂盒说明进行转染，将si-NC、si-CASC19、pcDNA-NC、pcDNA-CASC19、miR-NC、miR-152-3p、anti-miR-NC、anti-miR-152-3p转染至Saos2中，记为si-NC组、si-CASC19组、pcDNA-NC组、pcDNA-CASC19组、miR-NC组、miR-152-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-152-3p组；将si-CASC19分别与anti-miR-NC、anti-miR-152-3p共转染至Saos2中，记为si-CASC19+anti-miR-NC组、si-CASC19+anti-miR-152-3p组；将si-CASC19、anti-miR-152-3p分别与si-NC、si-HMGA2共转染至Saos2中，记为si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-NC组、si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-HMGA2组。

1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA CASC19、miR-152-3p、HMGA2 mRNA表达水平 各组细胞培养48 h，提取总RNA，检测RNA浓度及纯度，逆转成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3个重复，循环条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；72℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。CASC19和HMGA2以GAPDH为内参，miR-152-3p以U6为内参，CASC19上游引物序列：5’-GAGGAAGGCAGCACAATGATG-3’，下游引物序列：5’-CTTGCCAGTGTCTTCTCCTGA-3’；HMGA2上游引物序列：5’-CCCAAAGGCAGCAAAAACAA-3’，下游引物序列：5’-GCCTCTTGGCCGTTTTTCTC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；miR-152-3p上游引物序列：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACTG-3’，下游引物序列：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 蛋白质印迹(Western blot)法检测HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达 提取细胞总蛋白并用BCA试剂盒进行蛋白定量。取50 μl蛋白样品于10%的SDS-PAGE转至PVDF上，用5 %的牛血清蛋白封闭1 h。加入一抗4℃过夜，TBST洗膜3次；加入二抗室温培养1 h，再用TBST洗涤3次，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析各蛋白条带的灰度水平，蛋白表达水平=目的条带和β-actin条带的比值。每个蛋白样品设3个重复，实验重复3次。

1.5 CCK-8检测细胞活性 选择各组转染后培养48 h 的细胞，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测各组细胞490 nm波长处的吸光度值(OD)。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次，加入500 μl的结合缓冲液混匀。先加入10 μl的Annexin V-FITC室温避光孵育15 min，然后在上机前5 min再加入5 μl的PI进行染色，混匀后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。每管样品重复检测3次，每组设3个复孔。

1.7 双荧光素酶报告实验验证 CASC19和miR-152-3p以及miR-152-3p和HMGA2的靶向关系 构建含有miR-152-3p结合位点的lncRNA CASC19和HMGA2野生型及突变型报告基因载体，将其分别与miR-NC、miR-152-3p通过Lipofectamine 2000脂质体法共转染至Saos2细胞中，转染48 h后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 在骨肉瘤细胞系中，lncRNA CASC19、miR-152-3p、HMGA2表达情况 相较于人成骨细胞hFOB 1.19，骨肉瘤细胞Saos2、U2OS、HOS中lncRNA CASC19表达水平升高，miR-152-3p表达水平下降，HMGA2 mRNA和蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western Blot检测HMGA2蛋白的表达

表1 骨肉瘤细胞系中lncRNA CASC19、HMGA2和miR-152-3p表达量

2.2 低表达lncRNA CASC19对骨肉瘤细胞Saos2增殖和凋亡的影响 相较于si-NC组，si-CASC19组骨肉瘤细胞Saos2中lncRNA CASC19表达水平降低，HMGA2表达水平降低，CyclinD1表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2。

图2 低表达lncRNA CASC19对骨肉瘤细胞Saos2增殖和凋亡的影响；A 流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡；B Western Blot检测HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表2 低表达lncRNA CASC19对骨肉瘤细胞Saos2增殖和凋亡的影响

2.3 高表达miR-152-3p对骨肉瘤细胞Saos2增殖和凋亡的影响 相较于miR-NC组，miR-152-3p组骨肉瘤细胞Saos2中miR-152-3p表达水平升高，HMGA2表达水平降低，CyclinD1表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表3。

表3 高表达miR-152-3p对骨肉瘤细胞Saos2增殖和凋亡的影响

图3 Western Blot检测HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

2.4 lncRNA CASC19靶向miR-152-3p，miR-152-3p靶向HMGA2 通过Starbase软件预测显示CASC19可直接靶向结合miR-152-3p，miR-152-3p可直接靶向结合HMGA2。双荧光素酶报告基因验证结果显示，共转染miR-152-3p和野生型CASC19和HMGA2的载体时，荧光素酶活性显著下降(P<0.05)，而共转染miR-152-3p和靶向突变的CASC19和HMGA2的载体时，miR-152-3p对荧光素酶活性的抑制作用丧失。抑制CASC19表达后miR-152-3p表达水平升高(P<0.05)，过表达CASC19后miR-152-3p表达水平下降(P<0.05)；过表达miR-152-3p，HMGA2表达水平下降(P<0.05)，抑制miR-152-3p表达，HMGA2表达水平升高(P<0.05)。见表4～7,图4。

图4 lncRNA CASC19靶向miR-152-3p，miR-152-3p靶向HMGA2;A starbase预测miR-152-3p和CASC19的靶向关系；B starbase对HMGA2和miR-152-3p的预测示意图；C Western Blot检测HMGA2蛋白的表达

表4 miR-NC或miR-152-3p与CASC19野生型及突变型报告质粒共转染Saos2细胞后双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-152-3p的表达

表6 miR-NC或miR-152-3p与HMGA2-3’UTR野生型及突变型报告质粒共转染Saos2细胞后双荧光素酶活性检测

表7 Western Blot检测HMGA2蛋白的表达

2.5 低表达miR-152-3p可以部分逆转CASC19低表达对Saos2增殖和凋亡的影响 相较于si-CASC19+anti-miR-NC组，si-CASC19+anti-miR-152-3p组Saos2细胞中miR-152-3p表达水平降低，CyclinD1表达水平升高，Cleaved-caspase-3表达水平降低，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)见图5，表8。

图5 Western Blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表8 敲减miR-152-3p可以部分逆转CASC19低表达对Saos2增殖和凋亡的影响

2.6 低表达HMGA2可以逆转因敲减miR-152-3p对CASC19低表达逆转的影响 与si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-NC组相比，si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-HMGA2组HMGA2表达水平降低，CyclinD1表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图6，表9。

表9 低表达HMGA2可以部分逆转因敲减miR-152-3p对CASC19低表达逆转的影响

图6 Western Blot检测HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

3 讨论

研究表明，lncRNA和miRNA通过相互作用参与表观遗传、转录及转录后调控，参与恶性肿瘤的发生发展[11]。研究报道lncRNA CASC19与晚期胃癌的进展和预后有关，敲低CASC19抑制了体外胃癌细胞的增殖和迁移[12]。CASC19在非小细胞肺癌组织和细胞系中上调表达，高表达CASC19的患者生存率较差；CASC19通过mi-130b-3p调节ZEB2促进非小细胞肺癌的增殖，迁移和侵袭[13]。本实验结果显示，骨肉瘤细胞系中lncRNA CASC19高表达；CASC19低表达，CyclinD1表达水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平升高，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高。说明CASC19低表达抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。且本实验还发现CASC19靶向负调控miR-152-3p。

miRNA主要通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’ UTR)完全或部分互补结合，调控靶基因的表达，调节细胞增殖与凋亡影响肿瘤发生发展[14]。研究报道miR-152-3p通过抑制Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4，KLF4)表达在前列腺癌中发挥抑癌作用[15]。miR-152-3p通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶8(Cyclin-dependent kinase 8，CDK8)抑制节肝癌的发生[16]。lncRNA H19通过靶向miR-152-3p抑制溴结构域结合蛋白4(bromodomain containing protein 4，BRD4)介导的细胞增殖来抑制多发性骨髓瘤的发生[17]。本实验结果显示，骨肉瘤细胞系中miR-152-3p低表达，miR-152-3p高表达抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。且CASC19靶向调控miR-152-3p，miR-152-3p低表达逆转了CASC19低表达对Saos2增殖和凋亡的影响。提示，CASC19可能通过调控miR-152-3p的表达影响骨肉瘤细胞的增殖、凋亡。

已有的研究表明，HMGA2参与骨肉瘤的发生发展[9,10]；且研究报道miR-98的确通过与HMGA2结合来抑制乳腺癌细胞的增殖，侵袭，迁移并促进其凋亡[18]。实验结果显示，骨肉瘤细胞中HMGA2高表达，表明HMGA2确实与骨肉瘤的发生发展相关。研究表明lncRNA可通过竞争结合miRNA,调控miRNA的靶mRNA[19]。如lncRNA NEAT1通过miR-98-5p调控HMGA2影响前列腺癌的进展[20]。本研究中双荧光素酶报告基因实验证实了CASC19靶向负调控miR-152-3p，而miR-152-3p靶向负调控HMGA2。且低表达HMGA2逆转了因敲减miR-152-3p对CASC19低表达逆转的影响。以上资料均提示，CASC19可能通过miR-152-3p调节HMGA2的表达而影响骨肉瘤的增殖、凋亡。