miR-338-3p靶向FBXW7调控ox-LDL诱导的内皮细胞氧化应激和凋亡

邓永宜 何永桥 陈洁

动脉粥样硬化是临床常见疾病，也是心脑血管病的主要病理基础，其发病机制尚未完全清楚，且临床缺乏特异性的治疗药物[1]。血管内皮细胞是血管壁的主要屏障，其损伤和功能障碍是动脉粥样硬化发生的始动环节[2]。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可损伤内皮细胞，促进动脉粥样硬化的发生发展[3]。探讨影响ox-LDL诱导的内细细胞损伤的分子机制对于动脉粥样硬化治疗靶点的寻找具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子单链非编码RNA，可与其靶基因的3’端非翻译区(3’untranslated region，3’UTR)靶向结合，抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA，调控靶基因的表达，在细胞增殖、凋亡、氧化应激和炎症等一系列生命活动中发挥重要作用[4，5]。研究显示，miR-338-3p在卵巢癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌等肿瘤细胞中表达下调，过表达miR-338-3p可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为，是肿瘤治疗的潜在靶点[6-8]。但miR-338-3p对内皮细胞损伤的影响及机制尚不明确。Target scan生物信息学软件预测显示，F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7，FBXW7)是miR-338-3p的靶基因。FBXW7是SCF类泛素连接酶E3复合体中特异性识别底物的关键因子，参与调节细胞生长和凋亡等生命过程[9]。有报道FBXW7是体外内皮屏障功能的新型调节剂，其表达缺失通过间接调节Ras同源物基因家族成员B的活性，导致内皮细胞收缩力增加和内皮屏障破坏[10]。目前，miR-338-3p能否通过调节FBXW7参与内皮细胞损伤还未知。因此，本研究采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，探讨miR-338-3p靶向调控FBXW7对HUVECs细胞氧化应激和凋亡的影响及其机制，以期为动脉粥样硬化的靶向分子治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与实验试剂 HUVECs细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、高糖DMEM培养基、四甲基噻唑蓝(methylthiazoletrazolium，MTT)、胰蛋白酶、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，(美国Sigma公司)，LipofectamineTM 2000试剂盒(美国Invitrogen公司)，RNA抽屉试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，兔抗人FBXW7单克隆抗体和活化的半胱天冬酶-3多克隆抗体(Cleaved caspase-3)(美国Abcam公司)，miR-338-3p 模拟物(mimcs)及模拟阴性序列(miR-con)、miR-338-3p抑制剂(anti-miR-338-3p组)及抑制剂阴性序列(anti-miR-con)、FBXW7的小干扰RNA(si-FBXW7)及乱序无意义阴性序列(si-NC)(广州市锐博生物科技有限公司)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验方法

1.2.1 HUVECs细胞培养和转染：HUVECs复苏后，加入含10% FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、湿度97%培养箱中培养。每2～3天更换一次新鲜的培养基。当细胞生长密度为80%～90%时，0.25 %胰蛋白酶消化，以1∶3比例进行传代培养。取对数生长期的HUVECs细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞。当细胞生长密度为60%左右时，更换不含FBS的DMEM培养基。参照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书，将anti-miR-338-3p、anti-miR-con、anti-miR-338-3p与si-FBXW7、anti-miR-338-3p与si-con转染至细胞。转染后24 h，更换含10 % FBS的DMEM培养基。继续培养24 h，收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组：HUVECs细胞分为空白组、ox-LDL组(50 mg/L[11]ox-LDL诱导细胞)、ox-LDL+anti-miR-338-3p组(50 mg/L ox-LDL诱导转染anti-miR-338-3p的细胞)、ox-LDL+anti-miR-con组(50 mg/L ox-LDL诱导转染anti-miR-con的细胞)、ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-FBXW7组(50 mg/L ox-LDL诱导共转染anti-miR-338-3p和si-FBXW7的细胞)和ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-con组(50 mg/L ox-LDL诱导共转染anti-miR-338-3p和si-con的细胞)。每组设置3个复孔，各组细胞培养24 h后检测指标变化。实验重复3次。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-338-3p和FBXW7 mRNA表达：RNA抽屉试剂盒试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA浓度并进行定量。采用逆转录试剂盒将RNA合成为cDNA，以cDNA为模板扩增。引物序列：miR-338-3p上游5’-GTGCGAGTCGAGGCTGAACG-3’，下游5’-CGTGAAACGTGTAGCTGAT-3’；FBXW7上游5’-AAAGAGTTGT-TAGCGGTTCTCG-3’，下游5’-CCACATGGATACCAT-CAAACTG-3’；GAPDH上游5’-CGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’，下游5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT T-3’；U6上游5’-CGTGAAGCTGCCACGTACTG-3’，下5’-CCGATAACGTGTGGCGCGTG-3’。扩增程序：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共35个循环。miR-338-3p以U6为内参，FBXW7以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算miR-338-3p和FBXW7 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 Western blot法检测FBXW7和Cleaved caspase-3蛋白表达：细胞中加入RIPA蛋白裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min离心5 min，上清即为提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度后定量。取蛋白溶液，加入上样缓冲液，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，以每孔30 μg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离蛋白转至聚偏乙烯二氟膜，于5%脱脂牛奶中封闭2 h。分别用FBXW7和Cleaved caspase-3抗体4℃孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的二抗37℃孵育1 h。洗膜后，滴加ELC显影液，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。

1.2.5 酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中LDH及细胞中MDA含量、SOD和GSH-Px活力：细胞培养24 h后，收集上清液，3 500 r/min离心5 min，分别参照LDH试剂盒检测上清中LDH含量。胰蛋白酶消化细胞，分别参照MDA、SOD和GSH-Px试剂盒检测细胞中MDA含量和SOD、GSH-Px活力。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：细胞培养24 h后，吸弃培养基，胰蛋白酶消化细胞。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，取1.0×106个细胞，加入500 μl结合缓冲液，混悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC。室温避光孵育10 min。加入5 μl PI，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 miR-338-3p与FBXW7靶向关系验证：PCR扩增含miR-338-3p结合位点的FBXW7的3’UTR序列，克隆至pmir GLO载体，构建FBXW7野生型双荧光素报告质粒(WT-FBXW7)。利用基因定点突变技术将结合位点突变后，克隆至pmir GLO载体，构建FBXW7突变型双荧光素报告质粒(MUT-FBXW7)。分别将FBXW7-WT或FBXW7-MUT与miR-338-3p mimics、miR-con、anti-miR-con、anti-miR-338-3p共转染至HUVECs细胞。转染24 h后，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性，结果以荧光虫活性/海肾荧光强度比值表示各组的荧光素酶活性。同时分别转染miR-338-3p mimics、miR-con、anti-miR-con、anti-miR-338-3p至HUVECs细胞，转染24 h后，更换含10 %FBS的DMEM培养基。继续培养24 h后，Western blot法检测各组细胞中FBXW7蛋白表达，方法同1.2.4。

2 结果

2.1 ox-LDL对HUVECs细胞miR-338-3p和FBXW7表达的影响 与空白组比较，ox-LDL组miR-338-3p水平升高(P<0.05)，FBXW7 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western blot检测ox-LDL诱导HUVECs细胞后FBXW7蛋白表达

表1 ox-LDL诱导HUVECs细胞后miR-338-3p和FBXW7表达水平

2.2 抑制miR-338-3p对ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激的影响 与空白组比较，ox-LDL组MDA和LDH含量升高(P<0.05)，GSH-PX和SOD活力降低(P<0.05)。与ox-LDL+anti-miR-con组比较，ox-LDL+anti-miR-338-3p组MDA和LDH含量降低(P<0.05)，GSH-PX和SOD活力升高(P<0.05)。见表2。

表2 抑制miR-338-3p对ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激的影响

2.3 抑制miR-338-3p对ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡的影响 与空白组比较，ox-LDL组细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。与ox-LDL+anti-miR-con组比较，ox-LDL+anti-miR-338-3p组细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。见图2，表3。

图2 抑制miR-338-3p对ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡和Cleaved caspase-3蛋白表达的影响；A：流式细胞术检测HUVECs细胞凋亡；B：Western blot检测Cleaved caspase-3蛋白表达

表3 抑制miR-338-3p后ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平

2.4 miR-338-3p靶向FBXW7调控其表达 Target scan生物信息学软件预测显示， miR-338-3p与FBXW7的3’UTR存在连续结合位点。与miR-con组比较，miR-338-3p组共转染WT-FBXW7的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，而不影响MUT-FBXW7的荧光素酶活性(P>0.05)。与anti-miR-con组比较，anti-miR-338-3p组共转染WT-FBXW7的荧光素酶活性显著升高(P<0.05)，而不影响MUT-FBXW7的荧光素酶活性(P>0.05)。miR-338-3p组FBXW7蛋白水平低于miR-con组(P<0.05)，anti-miR-338-3p组FBXW7蛋白水平高于anti-miR-con组(P<0.05)。见图3，表4。

图3 miR-338-3p靶向调控FBXW7表达；A miR-338-3p与FBXW7的靶向结合位点；B Western blot检测miR-338-3p对HUVECs细胞中FBXW7蛋白表达的影响

表4 双荧光素酶报告实验结果和miR-338-3p对FBXW7蛋白表达的影响

2.5 沉默FBXW7降低抑制miR-338-3p对ox-LDL诱导的HUVECs细胞的保护作用 与ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-con组比较，ox-LDL+anti-miR-338-3p+si-FBXW7组MDA和LDH含量升高(P<0.05)，GSH-PX和SOD活力降低(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)。见表5，图4。

表5 si-FBXW7和anti-miR-338-3p对ox-LDL诱导HUVECs细胞损伤的影响

图4 si-FBXW7和anti-miR-338-3p对HUVECs细胞凋亡的影响；A Western blot检测FBXW7和Cleaved caspase-3蛋白表达；B流式细胞术检测HUVECs细胞凋亡

3 讨论

内皮细胞功能紊乱是一个复杂的过程，其是动脉粥样硬化形成的重要原因。ox-LDL可诱导内皮细胞产生氧化应激损伤、血管收缩性改变等病理性损伤的发生，进而促进动脉粥样硬化的发展[12]。细胞受损时，细胞膜通透性增加，导致LDH漏出，因此，细胞培养上清中LDH含量可反映细胞受损程度[13]。MDA是脂质过氧化产物之一，其含量高低可间接反映细胞氧化应激水平[14]。GSH-PX和SOD时机体内重要的抗氧化酶，可清除自由基保护机体组织受损[15]。本研究显示，ox-LDL作用HUVECs细胞后，细胞培养上清液中MDA和LDH含量升高，细胞中GSH-PX和SOD活力降低，提示在ox-LDL诱导作用下，HUVECs细胞产生氧化应激损伤。血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化病理发生的早期事件，可促进粥样硬化病变形成[16]。本研究显示，ox-LDL作用HUVECs细胞后，细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达升高，提示ox-LDL可能通过促进Cleaved caspase-3蛋白表达诱导HUVECs细胞凋亡。

miRNA参与调控内皮细胞结构和功能、增殖、凋亡及迁移等过程，与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。Yin等[17]研究显示，ox-LDL可促进HUVECs细胞表达miR-338-3p，且抑制miR-338-3p表达可降低ox-LDL诱导的HUVECs细胞凋亡，与本研究结果一致，提示miR-338-3p可能参与动脉粥样硬化形成。本研究还显示，抑制miR-338-3p可降低ox-LDL诱导的HUVECs细胞培养上清液中MDA和LDH含量，提高细胞中GSH-PX和SOD活力，提示抑制miR-338-3p表达可降低ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激，miR-338-3p可能是动脉粥样硬化治疗的分子靶点，靶向下调其表达可延缓动脉粥样硬化发展进程。

生物信息学软件预测显示，FBXW7可能是miR-338-3p的靶基因。研究表明，FBXW7参与血管内皮细胞迁移、内皮屏障完整性、血管生成以及动脉粥样硬化斑块形成等过程[18]，在心血管疾病发生发展过程中起重要作用。为了进一步探讨抑制miR-338-3p表达降低ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激和凋亡的作用机制，本研究通过双荧光素酶活性检测证实了miR-338-3p可与FBXW7的3’UTR靶向结合。此外，抑制miR-338-3p表达后，HUVECs细胞中FBXW7蛋白表达升高，而上调miR-338-3p表达后，FBXW7蛋白表达降低，进一步证实了miR-338-3p在HUVECs细胞中靶向负调控FBXW7表达。这也与ox-LDL诱导的HUVECs细胞后，miR-338-3p表达升高，而FBXW7的mRNA和蛋白表达降低的结果一致。本研究还显示，沉默FBXW7降低了抑制miR-338-3p对ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激和凋亡的抑制作用，提示miR-338-3p通过靶向上调FBXW7表达保护ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤。

综上所述，ox-LDL可诱导HUVECs细胞产生氧化应激和凋亡，损伤细胞。抑制miR-338-3p表达可能通过上调FBXW7表达降低，ox-LDL诱导的HUVECs细胞氧化应激和凋亡，保护内皮细胞损伤，可能是动脉粥样硬化的治疗的潜在靶点。