基于正交试验法优选制何首乌提取工艺

关键词：正交试验;二苯乙烯苷;游离蒽醌;提取工艺

何首乌为蓼科植物何首乌（PolygonummultiflorumThunb）的干燥块根，制何首乌为何首乌的炮制加工品，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊脂的作用[1]。制何首乌作为传统的补益类中药，在临床应用广泛。《中国药典》2020版一部更是收录了包括人参首乌胶囊、乙肝养阴活血颗粒等多种包含制何首乌的中成药。现代研究表明，何首乌中二苯乙烯苷、蒽醌类具有保护神经、改善记忆、保肝、消炎、抗菌等作用[2]。目前对何首乌的研究多集中在药材采收期、产地及饮片的炮制、质量变准、药理活性等方面，鲜有对其提取工艺的研究[3]。本研究以二苯乙烯苷、游离蒽醌为指标，通过考察提取溶剂、提取方法，确定制何首乌的最佳提取工艺，以期为制何首乌的开发提供依据。现报道如下：

1仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（waters 2996检测器），Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），AY220型电子天平（精确度为万分之一），sartotius.BP211D型电子天平（精确度为十万分之一），Anke TGL-16B离心机，南京金正教学仪器有限公司RE-201D旋转蒸发器，DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱，江苏国胜实验仪器厂HH-S恒温水浴锅。

1.2 试药

大黄素甲醚、大黄素、二苯乙烯苷，购自瑞芬思生物技术有限公司（批号：D-004-130315、D-029-130401、F-022-130512）。制何首乌饮片由贵州昌昊有限公司提供，产地贵州省从江县，经吴启南鉴定鉴定为蓼科植物何首乌Polygonummultiflorum Thunb的炮制品。甲醇与乙腈均为色谱纯，水为超纯水（实验室自制），乙醇（分析纯）。

2方法与结果

2.1 色谱条件与对照品的制备

色谱条件：固定相为Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），二苯乙烯苷：以乙腈-水（25∶75）为流动相;检测波长为320 nm。游离蒽醌：以甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）为流动相;检测波长为254 nm[1]。柱温均为25℃，流速：1 ml/min。

对照品溶液的制备：取2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含0.199 mg的溶液，即得。取大黄素对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成大黄素3.98 mg/100 ml、大黄素甲醚2.18 mg/100ml的溶液。

依照上述色谱条件，按照要求对对照品进行稀释，各进样10 µl，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的回归方程分别为Y=2.9×107X-97302，r=0.9998;Y=3.2×107X-13422，r=0.9999;Y=2.9×107X-4541.3，r=0.9999。

2.2 制首乌提取溶剂优选

2.2.1 样品的制备

取制何首乌饮片粗粉约8 g，分别加10倍量95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、水浸泡0.5 h，加热回流3次，每次回流1.5 h，滤过，合并滤液，95%乙醇定容到500 ml，分别取200 ml减压回收乙醇并浓缩。浓缩液置蒸发皿中，挥干溶剂，得到2份样品。

2.2.2 样品的测定

分別取不同提取方式得到的样品，一份置100 ml容量瓶中，取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于测定二苯乙烯苷含量。取另一份置100 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作为供试品溶液，测定游离蒽醌[3]。依照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 µl，注入液相色谱仪，记录各指标成分的含量。结果见表1。

2.3 制何首乌提取工艺优选

根据提取溶剂优选结果及前期实验结果，通过正交试验法，考察溶剂量、提取次数、乙醇浓度3个因素对制何首乌提取的影响，从而确定最佳的提取工艺。

2.3.1 样品的制备

取制首乌4 g，用所选溶剂浸泡0.5 h，按正交试验设计方案进行试验，依照制首乌提取溶剂优选中制备方法进行制备，最后得到2份样品。

2.3.2 样品溶液制备

取样品，一份置50 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容。取5 ml置25 ml容量瓶中，52.9%乙醇定容，用于测定二苯乙烯苷含量。取另一份置50 ml容量瓶中，取25 ml置50 ml容量瓶中，用甲醇定容，取5 ml作为供试品溶液。

2.3.3 测定法

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 µl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，运用回归方程计算含量。

2.3.4 正交试验及结果

分别取4 g制何首乌粉末，根据2.3.1的步骤，对样品进行处理，进行9组试验，实验结果及方差分析见表2～3。

由表2直观分析可知：KA3>KA2>KA1，KB3>KB2>KB1，KC2>KC3>KC1，极差结果显示因素影响性为B>C>A，故A3B3C2组合提取效果较好，即用10倍量60%乙醇回流3次。

由表3方差分析可知3个因素均无显著性差异。综合以上结果，在实验结果的基础上，结合实际的生产情况，确定A2B3C2为最终工艺，即用10倍量60%乙醇回流3次。在保证疗效的同时，降低生产成本。

2.4 工艺验证

称取4 g制首乌按照A2B3C2组合工艺条件进行加热回流，每组试验样品平行3份，依法测定。结果见表4。

工藝验证结果表明：A2B3C2组合中二苯乙烯苷、游离蒽醌的含量与正交工艺中的含量相当，差异较小。且A2B3C2组合工艺的RSD较小，工艺较为稳定。同时缩短生产周期，大大提高了经济效益，因此加热回流最佳工艺为10倍量60%乙醇回流3次。

3讨论

本实验首先通过HPLC法，以二苯乙烯苷、游离蒽醌为指标考察了不同提取溶剂对制何首乌的提取效果。通过查阅文献研究发现，提取溶剂、提取次数、溶剂量对饮片提取效果影响较为明显，故本研究选取上述3个因素，优选制何首乌的提取工艺。通过预实验，分别确定了3个因素的水平。

本实验采用加权综合评分法，对实验结果进行综合评分。文献研究表明，何首乌中主要的活性成分为二苯乙烯苷、蒽醌类化合物，其中二苯乙烯苷更是表现出多种生物活性，与制何首乌的补益作用更为相符[8]。

实验结果显示，二苯乙烯苷在60%乙醇条件下提取率较高，蒽醌在70%乙醇中提取率较高，提取结果与化学成分性质相符合A因素K3>K2>K1，其余两个因素K2最大，结果表明因素水平设计的合理性;极差结果显示提取次数对提取效果的影响最大，乙醇浓度次之，其与方差分析结果一致。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020：184.

[2]李帅锋，郑传柱，张丽，等.不同产地何首乌药材的质量分析[J].江苏中医药，2015，47（8）：69-71.

[3]杨建波，高慧宇，王雪婷，等.何首乌中1个新的木脂素酰胺类化合物[J].中草药，2021，52（18）：5475-5482.