肺泡巨噬细胞来源的微囊泡对肺损伤的作用

张蓝予，秦春妮，梁 影，陈书弘，黑飞龙

急性肺损伤发生率较高，感染、创伤、机械通气及体外循环等均可导致急性肺损伤［1－3］，中重度肺损伤的死亡率超过40%［4］，新冠肺炎所致重度肺损伤为致死的重要因素之一。 然而肺损伤的发病机制仍不十分明确。

细胞外囊泡是细胞间的沟通桥梁，包括凋亡小体，微囊泡（microvesicles， MVs）及外泌体，其在机体中的作用得到越来越广泛的关注。 新近研究表明肺损伤期间肺泡灌洗液中含有大量胞外囊泡［5］。 在肺损伤早期，巨噬细胞来源的胞外囊泡占据60%［5］。 而其中，MVs 为巨噬细胞产生的主要胞外囊泡类型［5－6］。 但MVs 对肺损伤的作用及机制仍待研究。 因而本项研究拟通过获取肺泡巨噬细胞来源的MVs 探究其对肺损伤的作用及潜在机制，拟为肺损伤提供基于胞外囊泡治疗新方向的参考。

1 材料与方法

1.1 肺泡巨噬细胞的培养 小鼠肺泡巨噬细胞系（mouse alveolar macrophage cell， MHS）（ATCC 公司），经RPMI－1640 培养基中添加10%胎牛血清（Gibico，美国）及1%双抗于T225 培养瓶（Corning，美国）中培养。培养箱条件：37℃，5% CO2。 待细胞量长至108，更换为去除囊泡的完全培养基并给予脂多糖（Lipopolysaccha⁃rides，LPS，Sigma Aldrich，美国）100 μg／L 或等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）刺激1 h。

1.2 提取肺泡巨噬细胞来源的MVs［6］收集刺激后的细胞上清，放入离心机（赛默飞，美国），300 g 4℃离心10 min 后，弃沉淀，上清液再次2 000 g 4℃离心20 min，弃沉淀，上清移入高速离心管中，放入高速离心机（贝克曼，美国）继续20 000 g 4℃离心30 min，离心后弃上清，PBS 重悬沉淀于20 000 g 4℃再次离心30 min，重复一次PBS 清洗，最终沉淀于PBS 重悬保存。

1.3 肺泡巨噬细胞来源的MVs 的鉴定 采用透射电镜（transmission electron microscope，TEM） 观察MVs 形态，纳米粒径追踪技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）观测MVs 数量及粒径分布。……