不同大黄制剂微生物限度检查方法的研究

易 伟 陆 崟 吴晶晶 苏 华 李 思

中国人民解放军东部战区总医院药剂科，江苏南京 210002

保肾片、新保肾片、肾炎宁片中主要成分均为大黄，文献表明，大黄的抑菌性较强[1-9]，大黄中有效成分蒽醌类对葡萄球菌、链球菌有显著抗菌活性[7]，同时对幽门螺杆菌[7]、大肠埃希菌[7]、肺炎克雷伯菌[8]、沙眼衣原体[9]等均有抑制作用。大黄的这种抑菌性可能影响制剂中污染的微生物，从而影响微生物检测结果。在微生物限度检查中，经常遇到有抑菌性的中药制剂，且抑菌性较难消除。若采用薄膜过滤法消除抑菌性就会使检验方法复杂繁琐、工作效率低。因此急需寻找一种合适的方法来消除中药制剂的抑菌性，建立其方便有效的检测方法。

由于中药制剂中利用中和剂消除抑菌性少有研究，因此本研究采用化学药品中常用的中和剂聚山梨酯80 和卵磷脂进行实验。文献表明，聚山梨酯80 是一种非离子表面活性剂，可增加药品溶解[10-12]，对微生物有一定的保护作用[13]；卵磷脂为两性离子表面活性剂，可降低季铵类、双胍类化合物活性，其可以修复细胞膜，对微生物无损伤作用[14-15]。两者联用可降低制剂的抑菌性[14-19]。本研究按照2015 年版《中华人民共和国药典》[20]四部通则1100 生物检查法，分别采用平皿法、稀释法、薄膜过滤法和中和法对保肾片、新保肾片和肾炎宁片进行研究，为大黄制剂微生物限度检查提供新思路。

1 仪器与试药

1.1 试药

保肾片（批号：20190426、20190527、20190612），新保肾片（批号：20190307、20190513、20190522），肾炎宁片（批号：20190506、20190520、20190701）均由中国人民解放军东部战区总医院药剂科提供。聚山梨酯80（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120517）；大豆卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180226）。

1.2 定量菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均为第4 代，规格为（1.0～2.0）×106cfu/支，均购自北京三药科技开发公司。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、蛋白胨均购自北京三药科技开发公司，按照2015 年版《中华人民共和国药典》[20]四部通则的要求进行培养基适用性检查，均符合要求。稀释剂：pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，依照2015 年版《中华人民共和国药典》[20]配制方法配制。

1.4 仪器

生物安全柜（型号：BHC-1000II/B3，苏净集团安泰公司）；高压蒸汽灭菌器（型号：SQ510C，雅马拓科技贸易有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（型号：PYX-DHS.500-BS，上海跃进医疗器械有限公司）；匀浆仪（型号：HTY-761，浙江泰林生物技术股份有限公司）；涡旋仪（型号：XW-80A，上海驰唐电子有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（型号：PYX-DHS-40×50，上海跃进医疗器械厂）；电子天平（型号：MP1100B、MP2001，上海恒平科学仪器有限公司，精密度：0.01 g）；霉菌培养箱（型号：MJ-160，上海恒科有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（型号：苏Q/WS2-175-79，连云港医疗器械设备厂）。

2 方法与结果

2.1 菌液的稀释

各取一支金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和白色念珠菌，放置室温。分别吸取菌株复溶液1 mL，混匀。用pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释剂）分别制成5000～10 000 cfu/mL 的菌悬液，备用。取4 代定量菌株大肠埃希菌一支，放置室温后，吸取菌株复溶液1 mL，混匀。用稀释剂制成50～100 cfu/mL 的菌悬液，备用。

2.2 计数方法适用性试验

2.2.1 平皿法（1∶10 供试液）

2.2.1.1 供试液制备：取保肾片（新保肾片、肾炎宁片）10 g，加稀释剂至100 mL，用匀浆仪研匀，制成1∶10供试液。

2.2.1.2 试验组：取1∶10 供试液9.9 mL，分别加入“2.1”项下菌液0.1 mL，混匀。取1 mL 注入平皿中，加入20 mL 培养基，平行制备2 份，测定菌落数。用于需氧菌计数的注入胰酪大豆胨琼脂培养基，并于30～35℃培养3～5 d。用于霉菌、酵母菌计数的注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，并于20～25℃培养5～7 d。

2.2.1.3 菌液组：取“2.1”项下的菌液0.1 mL，加入到9.9 mL 稀释剂中，混匀。取1 mL 注入平皿，加入20 mL培养基，平行制备2 份。用于需氧菌计数的注入胰酪大豆胨琼脂培养基，用于霉菌、酵母菌计数的注入沙氏葡萄糖琼脂培养基。测定每1 mL 菌液的菌落数。

2.2.1.4 供试品对照组：取1∶10 供试液1 mL 注入平皿中，加入相应培养基，测定供试品菌落数。

2.2.1.5 阴性对照组：取稀释剂1 mL，加入相应培养基，作为阴性对照。

2.2.2 稀释法（1∶50 供试液、1∶100 供试液）

2.2.2.1 稀释法1：取保肾片（新保肾片、肾炎宁片）10 g，加稀释剂至500 mL，用匀浆仪研匀，制成1∶50 供试液。将1∶50 供试液代替1∶10 供试液，其余操作同平皿法。

2.2.2.2 稀释法2：加稀释剂至1000 mL，其余操作同稀释法1。

按下例公式，计算回收率。结果见表1。

试验组回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数×100%

由表1 可见，保肾片、新保肾片对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌性，可采用1∶50 稀释级供试液（稀释法1）消除抑菌性。肾炎宁片对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌都有抑菌性，抑菌性较强，即使采用1∶100 供试液（稀释法2），也不能消除肾炎宁片抑菌性，故考虑薄膜过滤法。

表1 平皿法和稀释法测定结果（%）

2.2.3 薄膜过滤法

供试液、试验组、菌液组、供试品对照组、阴性对照组的制备方法同平皿法，取试验组、菌液组、供试品对照组1 mL，用0.1%蛋白胨300 mL 冲洗滤膜，滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基表面培养，测定菌落数。

肾炎宁片抑菌性较强，选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌进行薄膜过滤试验，结果发现滤膜上有一层褐色的中药残渣，直接影响菌落计数。且供试液在进行过滤时，流速很慢，操作效率较低。因此肾炎宁片不适合采用薄膜过滤法，可考虑用中和法进行试验。

2.2.4 中和法

2.2.4.1 含中和剂稀释剂：制备含3%聚山梨酯80 和0.3%卵磷脂的稀释剂，灭菌备用。

2.2.4.2 中和法1：取保肾片（新保肾片、肾炎宁片）10 g，加含中和剂稀释剂至100 mL，用匀浆仪研匀，制成含中和剂的1∶10 供试液。其余操作同平皿法。

2.2.4.3 中和法2：加含中和剂稀释剂至500 mL，其余操作同中和法1。

2.2.4.4 中和法3：加含中和剂稀释剂至1000 mL，其余操作同中和法1。

计算各菌回收率，结果见表2。

由表2 可见，采用3%聚山梨酯80 和0.3%卵磷脂作为中和剂，保肾片和新保肾片的1∶10 供试液对金黄色葡萄球菌的回收率提高。对于肾炎宁片，当采用中和剂时，肾炎宁片的1∶10 供试液仍有抑菌性，而采用1∶50 和1∶100 稀释级供试液可消除抑菌性，使回收率在0.5～2.0，符合2015 年版《中华人民共和国药典》[20]四部通则规定。

表2 中和法测定结果（%）

2.3 控制菌（大肠埃希菌）检查方法的验证

2.3.1 直接接种法

2.3.1.1 试验组：取“2.2.1.1”项下1∶10 供试液10 mL 及菌量≤100 cfu 的大肠埃希菌，加至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中。其余操作按2015 年版《中华人民共和国药典》[20]四部通则中大肠埃希菌检查法检查。

2.3.1.2 阳性对照组：用稀释剂代替供试液，按试验组操作加入试验菌，其他操作同试验组。

2.3.1.3 阴性对照组：用稀释剂代替供试液，不加试验菌，其他操作同试验组。

2.3.2 中和法

2.3.2.1 试验组：取“2.2.4.2”项下含中和剂1∶10 供试液10 mL，其余操作同直接接中法。

2.3.2.2 阳性对照组：用含中和剂稀释剂代替供试液，其余操作同直接接中法。

2.3.2.3 阴性对照组：用含中和剂稀释剂代替供试液，其余操作同直接接中法。

由表3 可以看出，直接接种法和中和法均可用于3 种大黄制剂的控制菌检查。

表3 大肠埃希菌试验结果

3 讨论

聚山梨酯80 和卵磷脂可用作中和剂降低药品的抑菌性，文献中多有报道[14-19]。本研究采用3%聚山梨酯80 和0.3%卵磷脂作为中和剂，中和剂对照组回收率均在1 左右，说明该中和剂无抑菌性。实验中，在制备含中和剂稀释剂时，应先用聚山梨酯80 溶解卵磷脂，再加入到稀释剂中，边加边搅拌，直至完全溶解，最后121℃湿热灭菌15 min 备用。

本研究采用了平皿法、稀释法、薄膜过滤法和中和法对保肾片、新保肾片和肾炎宁片进行微生物限度检查法研究，比较了稀释法、薄膜过滤法和中和法去除抑菌性的能力。本研究显示，保肾片、新保肾片的抑菌性较低，可采用稀释法或中和法进行试验；肾炎宁片抑菌性较强，需采用中和法结合稀释法才能消除其抑菌性。对于肾炎宁片，本研究也尝试过薄膜过滤法，发现供试液在过滤时会堵塞滤膜，过滤速度很慢，而且滤膜上的中药残渣也直接影响菌落的计数。在执行2015 版《中华人民共和国药典》之前，离心沉淀法是可行的[21-23]，但是2015 版《中华人民共和国药典》不再收录此方法，也有文献报道[24-25]离心沉淀法准确性、重现性差，是一种需改进的方法。由此可见，对于抑菌性较强的中药制剂，中和法是一个不错的选择，既降低了供试液的稀释度，也避免了薄膜过滤法产生的问题，使检验方法简单化、准确化。