精准定时输精对后备母猪早期胚胎发育与繁殖性能的影响

朱志伟，陈晓宇，于福先，张 樑，黄 菁，王志刚，赖建兵，沈顺新，殷文彬，潘建治，*

(1.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江 杭州 310021； 2.宁波旷代畜牧科技有限公司，浙江 宁波 315181； 3.浙江欣宏源生态农业有限公司，浙江 青田 313900； 4.安吉正新牧业有限公司，浙江 安吉 313300)

随着我国养猪业的发展，生猪养殖已步入规模化、集约化、技术化时代。后备母猪是猪场基础繁殖群的重要种用来源，以往传统后备母猪补充导入生产费时、费力、周期长、效率低，常常由于后备母猪发情迟缓、情期散乱不准、静立反应差而导致约30%的后备种群无法种用而作淘汰处理，影响猪场经济效益[1]。精准定时输精(fixed timed artificial insemination，FTAI)是通过使用激素人为调控母猪性周期，使之在预定的时间集中发情、排卵和配种的一项繁殖新技术[2-3]，FTAI技术不必对后备母猪进行发情鉴定，只需按FTAI程序在预定时间对后备母猪进行激素处理和配种，可大幅提高后备母猪配种利用率，缩短非生产天数，提高生产与管理效率。20世纪90年代德国与东欧一些国家86%的猪场利用FTAI技术实现了猪场的批次化生产管理[1]；而我国养猪业由于集约化、规模化程度不高，人工授精技术的普及效率不高，繁殖母猪科学管理程度不高等因素，对这项技术的研究与应用尚属于起步探索阶段。本研究主要是探讨定时输精技术对后备母猪早期胚胎发育和主要繁殖性能的影响，为定时输精技术在我国养猪业中的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以自主研发的生长速度快、肉质优的金乌黑猪(暂命名，源于杜洛克与金华地方猪)为材料，选取日龄220～240 d、体重110～120 kg的金乌黑猪43头、大长二元后备母猪189头，按试验方案要求随机分群。试验猪要求体况健康，无生殖疾病，饲养管理均按所在养殖场正常饲养方式执行。

试验处理所需烯丙孕素、孕马血清促性腺激素(PMSG)、促性腺激素释放激素(GnRH)均购买自宁波三生生物科技有限公司(批号：20180302)。

1.2 精准定时输精程序

参照宁波三生公司推荐的程序，试验开始投药前用果汁调教适应2 d，正式投药为每天15：00后，在喂料之前投药枪饲喂烯丙孕素20 mg·头-1，连续饲喂18 d，第19天停药1 d。第20天09：00给每头后备母猪肌肉注射PMSG 1 000 IU，第23天17：00每头后备母猪肌肉注射GnRH 100 μg，第24天17：00对所有后备母猪进行第1次配种，第25天09：00对所有后备母猪进行第2次配种，第26天上午对仍表现静立反应的母猪补配1次。

1.3 试验设计

试验1：金乌后备猪随机分群，实验开始后，对照组猪不做任何处理，每天进行发情鉴定，按照常规人工授精配种；定时输精试验组后备猪分别于0 h(停喂烯丙孕素)、42 h(肌注PMSG)、122 h(肌注GnRH)静脉采血5～10 mL，离心分离血清，检测促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P4)等生殖激素指标。试验组和对照组分别随机选择4头猪，在第2次配种结束后33 h屠宰双侧输卵管，冲洗回收早期受精卵，回收到的受精卵分别在PZM-5发育液进行体外培养5～7 d，培养条件：37.5 ℃，5% CO2，5% O2，95% N2，饱和湿度。

试验2：受试猪为大长后备母猪，试验开始后，对照组后备猪不做任何处理，每天进行发情鉴定，按照常规人工授精配种；试验组按精准定时输精程序操作。为观测精准定时输精程序对后备母猪的断奶仔猪存活情况的影响，试验时间延长到仔猪断奶结束。

1.4 妊娠诊断

配种后第28～30天对试验母猪进行B超诊断，检查是否受孕。

1.5 数据统计与数据分析

试验猪血清激素检测委托杭州金域医学检验所检测，试验过程中详细记录参繁母猪、发情母猪、入配母猪、妊娠数、分娩数、窝总仔、窝活仔、断奶数，计算配种率、妊娠率和参繁分娩率。实验数据先使用Excel 2010进行初步整理，后使用SPSS 22.0进行单因素方差分析，采用Duncan’s进行多重比较和差异显著性分析，结果使用平均值±标准差表示。

发情率(%)=发情母猪头数/参繁母猪头数×100；

配种率(%)=配种母猪头数/参繁母猪头数×100；

妊娠率(%)=情期妊娠头数/参繁母猪头数×100；

分娩率(%)=分娩母猪头数/参繁母猪头数×100。

2 结果与分析

2.1 定时输精对后备母猪发情生殖激素的影响

精准定时输精试验组的母猪于处理0、42、122 h采集的血样中4种激素测定结果如图1所示。P4值在0 h至42 h由3.71 nmol·L-1下降至2.71 nmol·L-1，但差异不显著(P>0.05)，在122 h时P4值下降至2.5 nmol·L-1(P>0.05)，表明停喂烯丙孕素后PMSG处理未对精准定时输精试验组母猪血液中的P4水平造成显著影响(图1-A)。E2值则在0 h至42 h由80 pmol·L-1显著(P<0.05)下降至58.3 pmol·L-1；42 h至122 h，E2值极显著(P<0.01)上升至134.07 pmol·L-1(图1-B)。FSH值在0 h至42 h由0.05 IU·L-1略增至0.07 IU·L-1(P>0.05)，在PMSG作用下上升到0.09 IU·L-1(P>0.05)，但与42 h时血液中FSH含量相比仍无显著性变化(图1-C)。LH值在0 h至42 h由0.09 IU·L-1上升至0.12 IU·L-1(P>0.05)，在PMSG作用下，LH值在122 h又降至0.09 IU·L-1(P>0.05)，呈现先升后降的趋势，但统计学上未见显著差异(图1-D)。

所有数据来自于14次独立重复试验结果，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。The data wa based on fourteen independent experiments，the different letter indicated significant difference (P<0.05)，and the same letters meant no significant difference (P>0.05).图1 停喂烯丙孕素后不同时间检测血液中各激素含量Fig.1 Levels of different hormones at different time points after cessation of allergenin

2.2 精准定时输精程序对后备母猪早期胚胎发育的影响

从表1可以看出，试验组和对照组后备金乌母猪头均排卵分别为17.5枚和15.25枚，差异不显著(P>0.05)；屠宰输卵管回收到的受精卵中单细胞、2-4-8细胞胚所占比率也未见显著差异(P>0.05)；体外培养发育的囊胚率差异也不显著(P>0.05)。胚胎形态结构无明显差异(图2)。这说明定时输精程序对后备母猪排卵数和早期胚胎发育无不良影响。

2.3 精准定时输精对试验金乌猪繁殖性能的影响

由表2可知，后备金乌母猪定时输精组与对照组的参与配种率分别为100%、90%，参繁分娩率分别为86.66%、85.00%，均无显著差异(P>0.05)。窝均总产仔数分别为10.69头、9.64头，窝均活仔数分别为10.46头、9.41头，组间差异不显著(P>0.05)；但与自然发情组相比，精准定时输精组母猪窝均总产仔数、窝均活仔数均提高约1.05头，这说明经FTAI程序处理不仅能提高后备母猪利用率，而且能提升窝均总产仔数与窝均活仔数。

2.4 精准定时输精对大长后备母猪主要繁殖性能的影响

表3显示，参繁大长后备母猪定时输精组的参配率和分娩率分别为100%与93.61%，比对照自然发情组后备猪的参配率(93.68%)、分娩率(89.47%)高，组间差异不显著(P>0.05)；定时输精组后备猪窝均活仔数11.1头，比对照组增加了0.58头，组间差异也不显著(P>0.05)；另外，定时输精组的断奶仔猪成活率高达91.91%，比对照组断奶成活率88.92%提高了2.99百分点，组间差异不显著(P>0.05)。说明精准定时输精不仅可提高后备母猪的利用率、增加窝均活仔数，也有利于提高仔猪断奶成活率。

表1 精准定时输精程序处理对后备母猪早期胚胎发育的影响

A、B、C：试验组胚胎，从左到右依次为2细胞期、4细胞期、囊胚期；D、E、F：对照组胚胎，从左到右依次为：2细胞期、4细胞期、囊胚期。标尺=100 μm。A，B，C: The embryo of FTAI group: 2 cell stage，4 cell stage and blastula stage; D，E，F: The embryo of control group: 2 cell stage，4 cell stage and blastula stage. Bar=100 μm.图2 胚胎早期发育情况Fig.2 Early embryonic development

表2 精准定时输精程序处理对金乌猪繁殖性能的影响

表3 精准定时输精程序对大长母猪繁殖性能的影响

3 结论与讨论

3.1 定时输精程序处理对后备母猪生殖激素的影响

母猪的正常发情周期启动是在促性腺激素释放激素、促卵泡素、促黄体素、雌激素、孕酮和催乳素(prolactin，PRL)等激素的共同调节作用下完成[4]。正常母猪的发情周期有黄体期和卵泡期。后备母猪定时输精是模拟正常发情周期各相关激素水平的互作机制，利用特定的外源激素人为干预达到在预设时间段内集中发情、排卵与配种。其中，饲喂外源激素烯丙孕素可维持生理周期的黄体期，维持体内相对高位的孕酮水平，抑制腺垂体FSH的快速分泌，避免卵泡的增长排卵；一旦体内孕酮水平下降就会刺激雌激素水平增加，促进腺垂体FSH与LH的分泌增加，促进卵泡的增大与发育，在这个过程中给予外源激素PMSG则有兼具FSH与LH的综合作用，能短期内辅助加速卵泡的发育；而一旦体内FSH水平达到一定峰值，则需要通过使用具有LH活性的促性腺激素如hcG或通过使用GnRH类似物来诱导排卵。本研究采用的是ALT+PMSG+GnRH式FTAI，血样采集时间为ALT停喂0、42、122 h，结果显示，从定时输精操作程序中外源药物的停喂(0 h)至肌注PMSG(42 h)，血浆P4值呈逐渐降低趋势；血浆E2值从80.0 pmol·L-1降至58.3 pmol·L-1，这主要是烯丙孕素的停喂解除了对腺垂体分泌FSH与LH的抑制，促进卵巢卵泡生长；在肌注PMSG(42 h)至肌注GnRH(122 h)，血浆E2值又上升至134.07 pmol·L-1，变化趋势与Guthrie等[5]的研究结果相一致。0～122 h，血浆FSH值呈上升趋势，而血浆LH值呈先上升后下降趋势，与Guthrie等[6]的研究结果类似。Guthrie等[6]认为，卵泡成熟过程中，随着E2增加，FSH存在减少的可能性，作者还证实卵泡排卵前黄体生成素含量升高发生的时间在停喂烯丙孕素后的5～6 d(122 h左右)。本试验结果证明，FTAI程序中外源激素的给予时间点能模拟猪正常生理周期激素变化，起到协同发情排卵的作用。

3.2 定时输精程序处理对后备母猪早期胚胎发育的影响

本试验结果显示，定时输精试验组猪卵巢排卵数比对照组增加，但差异不显著，囊胚发育率与自然发情猪无显著差异，说明定时输精程序不影响受精胚胎质量，这一结论与Degenstein等[7]的研究结果一致，其试验中采用烯丙孕素饲喂17 d+PMSG+hcG方式，hcG处理后50～55 h屠宰，测定的排卵后形成的红体有显著差异，卵巢残留的白体无显著差异，并且其研究表明胚胎数的增加与后备母猪窝均总产仔数、窝均活仔数的提高有直接关系。胚胎数的增加是因为定时输精程序中PMSG具有FSH和LH的联合作用，与自然发情内源性激素的规律性相比，能增加排出的卵泡数。Ravagnani等[8]研究表明，在18 d内使用ALT进行母猪发情同步，排卵率、胚胎数量、受精卵无显著差异，但增加了妊娠第28天的腺管面积、周长和子宫内膜总面积，因此为胚胎着床与妊娠提供了良好环境，也为最终母猪的窝均总产仔数、窝均活仔数的提高奠定了生理基础。

3.3 定时输精程序处理对后备母猪繁殖性能的影响

FTAI程序处理的后备母猪100%可以参繁生产，有效降低了后备母猪的淘汰率，而且操作简单、执行力强、效率高。本研究采用的是ALT+PMSG+GnRH式FTAI，2个不同品种后备猪试验结果均表明，参繁配种率、分娩率、窝均总产仔数、窝均活仔数均比对照组要高，这与Wang等[9]和Lopes等[10]的结果一致。这主要与FTAI程序中饲喂烯丙孕素一定时间后卵巢状态改善有一定关系，在协同使用PMSG下可获得更多的卵泡发育与同步排卵，从而提高受精率和窝产仔数。吴宝云等[11]比较了精准定时程序ALT+PMSG+GnRH与简式烯丙孕素式效果，结果表明，ALT+PMSG+GnRH式FTAI程序的窝均总产仔数、窝均活仔数比简式烯丙孕素式高。另外，本试验结果显示，后备母猪采用FTAI程序除了增加窝均总产仔数、窝均活仔数外，断奶成活率与自然发情猪相比提高了2.99百分点，这可能与FTAI生产的后代往往是批次式单元全进全出有一定关系，是否存在普遍性有待进一步研究。

综上，本研究中ALT+PMSG+GnRH式精准定时输精程序激素用药处理符合母猪生理发情周期特质，可增加排卵数，不影响早期胚胎发育，可提高后备母猪的利用率，增加窝均总产仔数、窝均活仔数，而且能提高仔猪断奶成活率，可由此实现规模猪场的生产批次化。