三株产吲哚乙酸根际促生芽孢杆菌的筛选鉴定及其促生作用

李福艳，刘晓玉，颜静婷，蔡燕飞

(华南农业大学 资源环境学院，广东 广州 510642)

化肥和农药的长期大量使用导致土壤遭到破坏、环境遭到污染，并引发农产品、农药残留等一系列问题。从多方面考虑，开发环境友好型、安全、绿色、能够持续性应用于农业生产的微生物肥料已成为现代农业的必由之路。植物根际促生菌(PGPR)是生活于植物根周围土壤或附着于根部的微生物[1]，能够通过活化土壤养分、改善植物根际营养、产生植物生长调节物质或抗菌活性物质、诱导植株系统抗性等作用直接或间接地促进植物的生长。例如：从杨树树体筛选到的吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)JK-SH007菌株对梨树、黄瓜、番茄的生长具有促进作用，并且该菌株能够防治杨树溃疡病[2-4]；解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B9601-Y2菌株对玉米叶斑病和茎基腐病都具有生防能力，并且具有促进植株生长的效果[5]。

植物根际促生菌种类丰富，其中研究较多的有芽孢杆菌、假单胞菌、农杆菌等。芽孢杆菌能够产生芽孢，对多种胁迫都有非常强的抗性，在一些极端环境下都能够生存下来[6]，这就使得芽孢杆菌菌剂的货架期长，田间适应能力强[7]。同时，芽孢杆菌还是植物根际促生菌中种类最丰富的一个属，其根际促生能力和相关机制已得到广泛的研究[8-9]，应用潜力十分广阔。

大猩猩芽孢杆菌(Bacillusmassiliogorillae)于2013年被Keita等[10]首次报道，2019年郑梅霞等[11]首次在国内分离出该菌。作为新型的菌种资源，大猩猩芽孢杆菌的各项功能及其基因资源尚未被深入研究。栗褐芽孢杆菌(Bacillusbadius)早在1918年就被分离出来，其溶藻、高产青霉素G酰化酶的特性也已得到广泛研究，但是其根际促生能力并未被深入探究。本研究从植物根际土壤中分离得到多株产吲哚乙酸(IAA)菌株，其中，YC9L、YC3172菌株属于大猩猩芽孢杆菌，YC5064菌株属于栗褐芽孢杆菌，对这3株菌的根际促生能力进行挖掘，并通过玉米种子发芽试验、生菜和玉米盆栽试验评价分析前述3株菌的根际促生能力。研究结果可为丰富根际促生芽孢杆菌的菌种资源、开发新型根际促生芽孢杆菌菌肥奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与植株

供试菌株由作者团队自行筛选，其中：YC9L筛选自广东省广州市天河区绿化带植被的根际土壤，YC3172筛选自华南农业大学农场玉米植株的根际土壤，YC5064筛选自华南农业大学农场生菜植株的根际土壤。

根据根际土壤样品采集来源，选择生菜和玉米作为研究菌株促生能力的供试植株，供试种子分别是北京思贝奇种子有限公司的大速生生菜种子，以及广东华农大种业有限公司的华金甜1号玉米种子。

1.1.2 培养基与试剂

LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

解钾液体培养基：葡萄糖5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO30.1 g，FeCl30.005 g，Ca3(PO4)22.0 g，钾长石2.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.5。

无机磷液体培养基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。

血琼脂培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，无菌脱脂纤维羊血100 mL，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.5。

1.2 试验方法

1.2.1 产IAA芽孢杆菌的分离与筛选

挖取植物根系，轻轻抖动植物的根，去除根部大块和松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集附着在植株根部的土壤样品。采集多株同种植物的根际土壤样品，置于无菌袋中。

取10 g土样于90 mL无菌水中，180 r·min-1振荡30 min，90 ℃水浴10 min，然后进行梯度稀释，涂布LB培养基平板，37 ℃倒置培养12 h，对不同形态的单菌落划线并编号。

通过菌株培养液IAA定性试验对所分离菌株进行初步筛选。将菌株接种至新鲜的4 mL液体LB培养基中(含100 mg·L-1的L-色氨酸)，30 ℃、180 r·min-1培养24 h。取菌液，加入等体积的Salkowski比色液，混匀，避光静置30 min进行显色反应，颜色变红者说明细菌有生产IAA的能力。记录可生产IAA的菌株，并进行拍照。IAA标准液(50 mg·L-1)和液体LB培养基(含100 mg·L-1L-色氨酸)分别作为阳性对照(CK+)和阴性对照(CK-)。

测定菌株培养液中IAA含量对初筛菌株进行复筛。菌液于16 500 r·min-1离心5 min，取上清液加入等体积Salkowski比色液混匀，避光静置30 min进行显色反应，然后测定其在530 nm下的吸光度，及菌液在600 nm下的吸光度(D600)。基于构建的IAA标准曲线，计算菌液D600=1时的IAA含量。选取产IAA能力在15 mg·L-1以上的菌株保存于甘油管中，-80 ℃保存备用。

1.2.2 菌株革兰氏、芽孢染色和溶血安全性测定

对供试菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，并用显微镜观察，以确定菌株类型。通过血琼脂培养基平板对菌株进行溶血试验，确定菌株的溶血安全性。

1.2.3 菌株16S rDNA分子鉴定

采用试剂盒法提取细菌的总DNA，用PCR法扩增YC9L、YC3172、YC5064菌株的16S rDNA，扩增引物分别为27F和1492R，并进行序列测定，将所测得的序列进行拼接，并在GenBank数据库中进行序列比对，采用Neighbor-Joining方法，用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.4 玉米种子发芽试验

用75%(体积分数)乙醇溶液处理玉米种子2 min，用水洗2遍，再用2%次氯酸钠溶液处理2 min，水洗2遍，无菌条件下晾干。采用所选菌株和空白对照进行对比试验：取100粒已消毒的玉米种子转至含有无菌滤纸的方形皿中，每皿接入10 mLD600=1.0的菌悬液，在25 ℃生化培养箱中培养7 d，每天浇水适量(每皿的水量相同)，7 d 后测定种子的发芽率、株高和根长。

1.2.5 生菜盆栽试验

取生菜种子进行催芽育苗，待苗长出3片叶子时移栽。采用长、宽、高分别为22.9、17.0、7.9 cm的花盆进行试验，每盆种4棵苗，每个处理种4盆。生菜移栽时，加入制备好的菌液至生菜植株的根部，使盆栽土中所施菌数达到106CFU·g-1，施加等量无菌生理盐水做对照(CK)。将盆栽置于人工气候箱中，日间20 ℃、16 h，晚上18 ℃、8 h，保持相对湿度80%～90%。各盆随机放置，根据情况每天施加等量水。分别于10、20、30 d后进行第2、3、4次施菌(施菌量与施菌方法同第1次)。移栽40 d后，对生菜植株进行收样，测定并记录每个处理组生菜植株的株高、根长、叶长、茎粗、叶宽、鲜重。

1.2.6 玉米盆栽试验

取玉米种子进行催芽育苗，待玉米苗长出3片叶子时移栽。采用内径12.5 cm、高11.5 cm的圆形花盆进行试验，每盆种3棵玉米苗，每个处理组5盆。玉米移栽时，加入制备好的菌液至玉米植株的根部，使盆栽土中所施菌数达到106CFU·g-1，施加等量无菌生理盐水做对照(CK)。盆栽放置于网室中，各盆随机放置，根据情况每天施加等量水。7 d后进行第2次施菌(施菌量与施菌方法同第1次)。移栽14 d后，对玉米植株进行收样，测定并记录每个处理组玉米植株的株高、叶长、根长、茎粗、叶宽、根干重、叶干重。

1.2.7 菌株解钾能力测定

将培养至D600=0.4的新鲜菌液接种于含有50 mL解钾液体培养基的250 mL摇瓶中，接种量为1%(体积分数)，在30 ℃、180 r·min-1条件下培养3 d。将培养液在8 000 r·min-1的条件下离心5 min，取上清液采用火焰光度计法测定其中水溶性钾的含量，以解钾液体培养基同步培养3 d的上清液为对照。

1.2.8 菌株解磷能力测定

将培养至D600=0.4的新鲜菌液接种于含有50 mL无机磷液体培养基的250 mL摇瓶中，接种量为1%(体积分数)，在30 ℃、180 r·min-1条件下培养3 d。将培养液在10 000 r·min-1条件下离心5 min，取2 mL上清液，稀释至30 mL，转移至50 mL容量瓶，滴加2滴二硝基酚，通过调整pH将溶液颜色调至微黄色，吸取5 mL钼锑抗显色剂加至上述溶液，混匀定容，室温放置30 min，测定其在720 nm下的吸光度。发酵液的水溶性磷含量通过磷标准曲线计算得到。

1.2.9 菌株耐重金属能力测定

取100 μLD600=0.4的新鲜菌液加入到50～60 ℃的4 mL含0.7%(质量分数)琼脂的LB固体培养基中，混匀，倒在含1.5%(质量分数)琼脂的LB固体培养基上，吹风20 min。将无菌滤纸片放于平板中央，滴加10 μL的50 mmol·L-1Cd2+、100 mmol·L-1Zn2+、400 mmol·L-1Cu2+，吹干后于37 ℃培养24 h。用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)模式菌株NCIB3610作为对照，记录透明圈直径。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 25.0软件进行数据处理和方差分析，对有显著(P<0.05)差异的，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。本文图、表中的数据均为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 产IAA芽孢杆菌的筛选

从植物根际采集土壤，通过稀释涂布法，筛选出菌落形态不同的菌株，并通过Salkowski比色法和IAA标准曲线对所筛选菌株进行产IAA能力的定性定量测定(图1、图2)。产IAA能力达15 mg·L-1以上的菌株共有14株，其中，YC9L、YC3172和YC5064菌株产IAA的能力最强，分别达46.72、79.75、67.55 mg·L-1。结合所筛菌株的培养特性、产IAA能力，以及稳定性，选取菌株YC9L、YC3172和YC5064进行后续研究。

图1 所筛菌株的产IAA能力定性结果Fig.1 Qualitative results of IAA produced by strains

柱上无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.图2 所筛菌株的产IAA能力定量结果Fig.2 Quantitative results of IAA produced by strains

2.2 菌株革兰氏、芽孢染色和溶血安全性

于100倍油镜下观察YC9L、YC3172和YC5064的革兰氏染色和芽孢染色结果，YC9L、YC3172和YC5064都为革兰氏阳性菌，并且都能产芽孢(图3)。血琼脂平板试验结果显示，所筛选的3株菌均无溶血现象(图4)，均为溶血阴性，具有溶血安全性，可作为微生物肥生产菌种的候选菌株。

2.3 菌株16S rDNA分子鉴定

扩增菌株YC9L、YC3172和YC5064的16S rDNA序列，并进行BLAST比对，结果表明：菌株YC9L和YC3172同大猩猩芽孢杆菌BacillusmassiliogorillaeG2菌株的亲缘关系最近；菌株YC5064同栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusNBRC 15713菌株的亲缘关系最近。基于构建的系统发育树(图5)，结合菌株的培养特性，初步鉴定菌株YC9L、YC3172为大猩猩芽孢杆菌(B.massiliogorillae)，分别命名为B.massiliogorillaeYC9L、B.massiliogorillaeYC3172；鉴定菌株YC5064为栗褐芽孢杆菌(B.badius)，命名为B.badiusYC5064。

2.4 菌株对玉米种子发芽的促进效果

玉米种子发芽试验表明，接种YC9L组的发芽率为45%，接种YC5064组的发芽率为43%，CK为39%。同CK相比，接种YC9L组的玉米株高显著(P<0.05)增长了25.45%，根长显著(P<0.05)增长了202.96%(表1、图6)，接种YC5064组的根长显著(P<0.05)增长了80%。可见，YC9L菌株能促进玉米种子发芽，且对玉米芽、根的生长有显著的促进效果；YC5064菌株能够提高玉米种子的发芽率，且对玉米种子根的伸长具有促进作用。

图3 菌株的革兰氏染色与芽孢染色图Fig.3 Microscopy results of Gram staining and spore staining of strains

图4 菌株溶血试验结果Fig.4 Hemolysis results of strains

图5 基于YC9L、YC3172、YC5064菌株16S rDNA基因序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of YC9L，YC3172，YC5064 strains based on 16S rDNA gene sequences

2.5 菌株对生菜植株生长的促进作用

生菜盆栽试验结果表明，菌株YC9L、YC3172和YC5064均能有效促进生菜的生长(表2、图7)。与CK相比，接种YC9L、YC3172、YC5064组的株高分别显著(P<0.05)提高了17.74%、16.32%、20.35%，叶长分别显著(P<0.05)提高了22.12%、21.64%、17.84%，茎粗分别显著(P<0.05)提高了27.53%、23.69%、35.89%，叶宽分别显著(P<0.05)提高了18.35%、22.10%、18.54%，鲜重分别显著(P<0.05)提高了51.08%、59.69%、56.62%。接种YC3172组的根长较CK显著(P<0.05)提高了20.81%，但接种YC9L、YC5064组的根长同CK相比无显著差异。

表1 不同处理对玉米种子发芽的影响

2.6 菌株对玉米植株生长的促进作用

玉米盆栽试验结果表明，与CK相比，接种YC9L组的玉米株高、叶长、茎粗、叶宽、根干重、叶干重分别显著(P<0.05)提高了6.35%、7.46%、19.13%、10.23%、41.67%、24.32%(表3，图8)，接种YC3172组的玉米茎粗显著(P<0.05)提高了16.01%，接种YC5064组的玉米茎粗、叶宽分别显著(P<0.05)提高了12.27%和8.37%。这说明，接种这3株菌对玉米生长均具有促生效果，其中，以YC9L菌株对玉米植株的促生作用最为明显。

表2 不同处理对生菜植株生物量的影响

2.7 菌株的解钾能力

菌株YC9L、YC3172、YC5064培养液中的水溶性钾含量分别为7.27、6.97、6.35 mg·L-1(图9)，均显著(P<0.05)高于不接菌的空白对照(CK)，表明YC9L、YC3172和YC5064菌株都有解钾能力，其中，YC9L和YC3172菌株的解钾能力更强。

2.8 菌株的解磷能力

菌株YC9L、YC3172培养液中的水溶性磷含量分别为20.61、90.30 mg·L-1(图10)，显著(P<0.05)高于不接菌的空白对照(CK)，说明YC9L、YC3172菌株都具有解磷能力，其中YC3172菌株的解磷能力较强。

2.9 菌株对重金属Cd、Cu、Zn的耐性

通过平板斑点草坪法(spot-on-lawn assay)，以枯草芽孢杆菌模式菌株NCIB3610为对照，研究YC9L、YC3172和YC5064菌株在重金属Cd、Zn、Cu胁迫下的抗性(图11)。结果表明，菌株YC9L、YC3172和YC5064对50 mmol·L-1Cd2+、100 mmol·L-1Zn2+，400 mmol·L-1Cu2+均具有明显抗性，其中，YC5064菌株对Cd的抗性较强，YC9L、YC3172菌株对Zn和Cu的抗性较强。

3 讨论

IAA作为一种在植物体内发挥重要调节作用的植物激素，不仅植物自身能够合成，微生物，包括细菌、真菌都能够合成。外源合成的IAA在适宜的浓度下同样能够促进植物的生长[12-15]。研究表明，多种植物根际促生菌都能分泌IAA。万水霞等[16]从玉米根际筛选到的BacillusaryabhattaiCH07和StreptomycesmaritimusFD11菌株，IAA产量分别为30.93、15.93 mg·L-1。林英等[17]从香樟根际筛选到22株植物根际促生菌，其中假单胞菌(Pseudomonassp.)XZ11菌株和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)XZ13菌株产IAA的能力最强，产量分别为46.82、46.19 mg·L-1。杨茉等[18]从辣椒植株根际土壤中分离到58株根际细菌，其中N1、N16、N32具有分泌IAA的能力，产量分别为18.49、3.56、0.04 mg·L-1。本研究筛选到能够产IAA，且IAA产量达15 mg·L-1以上的菌株14株，其中，YC9L、YC3172、YC5064产IAA的能力最强，产量分别达46.72、79.75、67.55 mg·L-1。与前述研究相比，本研究筛选的3株菌表现出优秀的产IAA能力，在根际促生方面具有非常大的开发潜力。

图7 YC9L、YC3172和YC5064菌株对生菜的促生效果Fig.7 Growth promoting effect of YC9L，YC3172，YC5064 strains on lettuce growth

表3 不同处理对玉米植株生物量的影响

研究表明，多种植物根际促生菌，包括假单胞菌、根瘤菌、固氮螺菌、芽孢杆菌等，都能通过分泌IAA来促进植株的生长。由于芽孢杆菌具有抗逆性强的特点，近年来，根际促生芽孢杆菌得到了广泛的研究。贾西贝等[19]筛选出短小芽孢杆菌BG-5，能够促进拟南芥的生长；Park等[20]从大豆根际筛选到阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)，能够产IAA，并且能够增强大豆的耐热能力；李培根等[21]筛选的阿氏芽孢杆菌HL379菌株，IAA产量为47.8 mg·L-1，能够提高马铃薯植株的生物量、增加马铃薯产量。用枯草芽孢杆菌CM4悬浮液处理山药，与未用细菌悬浮液处理的山药相比，其根和茎的生物量均有所提高[22]。但是，目前报道的可产IAA的根际促生芽孢杆菌大多是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegateriumde Bary)、阿氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等，能应用到实际农业生产中的根际促生芽孢杆菌种类更少。许多研究表明，植物根际促生菌可以通过一种或者多种作用协同促进植株的生长[23]，这些作用主要包括分泌植物激素促进植物生长，植物病害的生物防治，土壤养分活化，缓解土壤中重金属、土壤盐渍化、土壤酸化等对植株的胁迫作用[24-27]，但是现在报道的大多数产IAA的根际促生芽孢杆菌的根际促生能力较为单一；所以，挖掘芽孢杆菌的多种根际促生功能，筛选新型具有产IAA能力的多功能根际促生芽孢杆菌对菌肥的研究与应用来说具有非常积极的意义。

图8 YC9L、YC3172、YC5064菌株对玉米的促生效果Fig.8 Growth promoting effect of YC9L，YC3172，YC5064 strains on maize growth

图9 YC9L、YC3172、YC5064菌株的解钾能力Fig.9 Potassium-dissolving characteristics of strain YC9L，YC3172，YC5064

图10 YC9L、YC3172、YC5064菌株的解磷能力Fig.10 Phosphorus-dissolving characteristics of strain YC9L，YC3172，YC5064

图11 不同菌株对重金属镉、锌、铜胁迫的敏感性Fig.11 Sensitivity of different stains to Cd，Zn，Cu stress

大猩猩芽孢杆菌是一种兼性厌氧、革兰氏可变、菌体形态为杆状的芽孢杆菌。关于大猩猩芽孢杆菌，国内外的研究甚少。作为一种新型的菌株资源，大猩猩芽孢杆菌在根际促生方面的特性和功能基因并未得到挖掘，关于其在植物促生、土壤养分活化、重金属胁迫方面的效果更是鲜见报道。栗褐芽孢杆菌是较早发现的芽孢杆菌属物种之一。研究发现，栗褐芽孢杆菌具有解磷、产IAA等根际促生特性[28-30]。Gopinath等[31]发现，栗褐芽孢杆菌M12菌株含有非挥发性的IAA和其他化合物的胞外提取物，在愈伤组织生物测定中促进了多个芽和根的萌发。这些研究结论与本研究结果一致，说明栗褐芽孢杆菌在植物根际促生方面具有研究潜能。但是，现有的关于栗褐芽孢杆菌根际促生的研究结果仅仅只是局限于功能特性的解析，并未进行盆栽试验或者田间试验。

本研究从植物根际筛选出3株高产IAA的根际促生芽孢杆菌，其中，YC9L和YC3172鉴定为大猩猩芽孢杆菌，YC5064鉴定为栗褐芽孢杆菌。这3株菌在生菜和玉米盆栽试验上表现出明显的促生能力，同时兼具解磷、解钾和耐重金属胁迫的能力，在植物根际促生方面具有巨大的开发应用潜力，值得进一步深入开展田间试验，为新型根际促生芽孢杆菌微生物菌肥的开发提供菌种资源。