NRG-1 基于PI3K/AKT 通路对心肌梗死心衰大鼠心肌保护作用

宋燕

心血管疾病仍是世界范围内引起死亡的主要原因[1]，目前，我国心血管疾病患者约2.9 亿，其中心肌梗死患者多达250 万，随着生活水平的提高、人口老龄化的加剧，心肌梗死患者将进一步增加。心肌梗死是因冠状动脉中胆固醇堆积于血管壁上，于内膜产生脂肪块，被侵犯之组织形成动脉粥状硬化，引起局部反应，而形成血栓[2]。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）症状通常为突然发作，且伴随严重胸痛，出现冒冷汗、呼吸、血压下降、虚弱苍白、焦虑不安等症状。如果症状未及时治疗，可能发生心力衰竭、心律不整休克等合并症，严重时会导致死亡。急性心肌梗死的死亡率极高的内科疾病，在治疗时，诊断时间与处置时间越短，所保存的心脏功能越好[3]。相反的，处置时间越长，心力衰竭的可能性越大，故目前主要治疗方式以恢复心肌血液的灌流为主。心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指AMI 恢复再灌注后心肌组织产生的不可逆性的损伤[4]，是再灌注治疗后常见的并发症，其实质是缺血状态的延续和叠加[5]。由于心肌细胞是一种不会再生的终末分化细胞，因此在治疗中拯救心肌功能是急性心梗发生后比较重要的关键一步，MIRI 已成为困扰临床医生的一大难题。MIRI 的发生发展机制复杂，目前尚未完全阐明。本实验拟设计合成神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）的腺病毒过表达载体，对心肌细胞进行缺氧复氧处理，以模拟急性心肌梗死时的心肌细胞状态，研究NRG-1 基于PI3K/AKT 通路促进心肌梗死心衰大鼠心肌细胞存活与血管生成的作用，并探讨其机制，为NRG-1 基因治疗心脏疾病的机制进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取24 只SPF 级的健康成年雄性SD 大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证：SCXK（泸）2012-0002，8 ～10周的周龄，体质量（298±38）g。饲养环境是（25±3）℃的温度、40%～70%的湿度，给予光照12 h/天，食物和水自由摄取和饮用。

1.2 实验仪器与设备

电子天平，光学显微镜，组织摊片机，石蜡切片机（德国Leica 公司），紫外可见分光光度计。Masson 染色试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司），尹红液染液、苏木素染液（北京中杉金桥生物技术公司），抗AKT（pan）、抗P-AKT、抗PI3K（美国CST 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立与分组 选取24 只同批次SPF 级的雄性成年SD 大鼠，随机分为3 组：假手术组（n=8），模型组（n=8）和 NRG-1 因子干预组（NRG 组，n=8）。假手术组为AMI 心衰模型，假手术组只开胸不结扎冠脉。术中注意无菌操作，术后予以保暖复苏。造模成功2 h，NRG 组经尾静脉注射NRG-1因子（10 μg/kg），假手术组和模型组大鼠经尾静脉注射等量 0.9%氯化钠溶液。

1.3.2 HE 染色 在光学显微镜下（×200）观察心肌组织病理变化，并随机选择5 个视野图像采集记录做HE 染色评分。

1.3.3 免疫印记检测 免疫印迹法（western blot，WB）分析心肌组织PI3K、AKT、P-AKT 蛋白的表达情况。使用odyssey 软件对图像进行分析。使用PS6 和AI 软件对条带图片进行拼图组合。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0 统计软件包进行统计分析结果。所有计量资料用（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色情况

假手术组大鼠心肌组织排列规则、较紧密，胞质染色均匀成粉红色，细胞核形态规则，椭圆居中。模型组组梗死区心肌细胞增粗，排列紊乱、间隙增大，细胞膜破坏，胞质不均。与模型组相比，NRG 组大鼠炎症坏死和纤维化程度有所改善，缺血核心区和周边区 HE 评分和 CVF 显着降低（P均＜0.05）。见图1。

2.2 三组大鼠心肌组织中 PI3K、AKT 和P-AKT 的WB 表达情况

使用免疫印迹法（western blot，WB）检测三组大鼠心肌组织中梗死区域和梗死周边区域的PI3K 和P-AKT 蛋白的表达情况，与模型组相比，NRG 组梗死核心区和梗死周边区PI3K、P-AKT相对表达量明显增加（P＜0.05）。见图2 和表1。

表1 三组大鼠心肌组织中PI3K、AKT 和P-AKT 的相对表达情况 （ ±s）

表1 三组大鼠心肌组织中PI3K、AKT 和P-AKT 的相对表达情况 （ ±s）

组别例数 P-PI3K（GAPDH） P-AKT（GAPDH）假手术组 81.01±0.031.02±0.04模型组 80.62±0.05* 0.63±0.06*NRG 组 81.32±0.08a △ 1.33±0.09a △

图1 各组HE 染色图（×200）

图2 PI3K、AKT 和P-AKT 的WB 表达

注：与假手术组相比，*P=0.000，aP=0.000；与模型组相比，△P=0.000

3 讨论

急性心肌梗死是一种缺血性心肌病，容易造成致死率，主要是由于冠状动脉阻塞引起心肌供血完全或不完全阻断，进而导致心肌细胞死亡和心脏重塑，是这些患者心力衰竭的最重要危险因素[6]。对于心肌梗死患者来说，如果冠状动脉狭窄或阻塞，心脏无法获得足够氧气及养分，造成心绞痛的症状，如果因粥状斑块剥落，会导致冠状动脉阻塞，使心肌功能缺损，影响心肌收缩功能，导致心肌局部缺氧，20 ～40 min 即造成心肌受损，60 min 后变成心肌梗死[7]。使肺部组织及肺泡内渗出液增加，形成急性肺水肿，以24 ～48 h 内死亡率最高。通常是突然发作且伴随剧烈胸痛，冒冷汗、焦虑不安、虚弱无力、恶心、呕吐、眩晕与呼吸困难，急性期常见并发症为心律不整、心因性休克、肺水肿，严重则导致死亡[8-9]。

急性心肌梗死的常用的治疗方式有药物治疗及经皮冠状动脉介入疗法（percutaneous coronary intervention，PCI）及冠状动脉搭桥手术（coronary artery bypass surgery，CABG）等，医生依据病情严重性给予适当的治疗。药物治疗是采用血栓溶剂治疗，药物治疗包含阿司匹林、血小板凝集抑制剂、乙型肾上腺接收阻断剂、血清收缩素转换抑制剂等[10]。然而治疗非每位患者均适用血栓溶剂，必须是急性心肌梗死发生6 小时内，无出血疾病或出血倾向，年龄最好在70 岁以下，在上述情形下医生才可能会考虑给予血栓溶剂药物治疗。因超过6 h 后再予血栓溶剂药物，出血的可能性便高，老年人由于动脉已硬化，使用血栓溶剂药物发生脑出血的可能性增加。经皮冠状动脉介入疗法（PCI）包含经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA），及冠状动脉血管支架植入。经皮冠状动脉介入疗法五年后，经皮冠状动脉腔内成形术的死亡率、再阻塞性、并发症及总医疗费用，较血栓溶剂低。经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）是利用末端附有可膨胀球囊的导管，经由周边静脉进入主动脉，再进入冠状动脉到达狭窄部位，再球囊膨胀将部位撑开狭窄部位，手术后仍需注意防止血栓及狭窄的再发生[11]。然而经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）对于某些复杂病灶如极度狭窄、偏心性狭窄等的治疗效果并不理想，且可能30%～50%发生再狭窄，故为避免再狭窄的发生，故目前常合并使用血管支架以达预期改善及狭窄的再发生。

神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）大家族的一部分，可以很好对心脏起到保护以及维持正常发育的作用，一般在内皮细胞中表达，而其受体ErbB2 和ErbB4 则在心肌细胞膜上表达。NRG-1 与受体ErbB 结合后，会释放这三种下游信号通路，他们分别是：PI3K/AKT，MEK/ERK1/2 和Src/FAK。其中，PI3K/AKT 通路是可以对心肌细胞的生长代谢起到调节效果，有很好的保护作用。该通路在调节细胞分化中尤为重要，而PI3K/AKT 通路与新生血管的发生密切相关。已有研究证实，PI3K/ Akt 通路大概会对内皮细胞进行繁殖分化，激活PI3K/AKT 通路可减缓心室重构，从而很好保护了心肌功能。有研究表明内源性Ang2 可促进PI3K/AKT 活性，对内皮细胞一系列活动有促进作用[12]。有研究[13]发现NRG-1 可以对小鼠的一些病理过程有调节作用，如心力衰竭、糖尿病性心肌病、心肌缺血再灌注等等。所以说NRG-1 可能在AMI 发生之后通过PI3K/AKT 信号通路发挥了保护心肌细胞并推动血管生成作用，但关于NRG-1 与PI3K/AKT 信号通路对于心肌细胞保护及血管新生作用的机制少有报道。通过本研究表明，与模型组相比，NRG 组大鼠炎症坏死和纤维化程度有所改善，缺血核心区和周边区HE 评分和CVF 显着降低。与模型组相比，NRG 组梗死核心区和梗死周边区PI3K、P-AKT 相对表达量明显增加。综上所述，治疗性血管新生是能够对心肌增加供血的一种新方法。这种治疗方式为一些不适合进行标准血运重建技术的患者增加了一个新的治疗策略。AMI 中的治疗性血管生成对临床是有着显著的潜力。因此，NRG-1 可以促进心肌梗死心衰大鼠缺血心肌血管生成。NRG-1 促进心梗大鼠心肌血管生成的机制可能与PI3K/AKT 通路激活和蛋白表达上调有关。

综上所述，NRG-1 可以促进心肌梗死心衰大鼠缺血心肌血管生成，而这种机制可能与PI3K/AKT 通路激活和蛋白表达上调有关。