酱香型大曲中产酱香芽孢杆菌的代谢产物分析研究

侯智勇，刘阳

(四川旅游学院，成都 610100)

酱香在我国已有上千年历史，因其香味独特、应用广泛、独具魅力而受到大众喜爱，同时其产香机理及风味成分复杂，使得众多研究者致力于酱香风味成分的研究[1-4]。对于产酱香微生物已有些报道，许多研究结果显示芽孢杆菌与产酱香风味关联度比较大[5-6]，这些微生物的代谢活动与发酵过程中物理化学反应的相互重迭作用，最终形成了酱香型白酒中一系列特殊的风味物质[7]。高温大曲中的微生物对酱香风味的形成尤为重要。罗建超等[8]曾从茅台酒的大曲中分离出产酱香芽孢杆菌并初步探析其代谢产香；黄永光等[9]也从酱香型白酒生产制曲、堆积酒醅和发酵期酒醅中分离出地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，并详述了三类产香芽孢杆菌发酵代谢产香的特征性成分、特征性酶、产香过程风味的特征性变化和群体微生物发酵机制。可见，对高温大曲中微生物的研究，特别是芽孢杆菌的深入研究分析，有利于揭示酱香的形成机制。

本研究从酱香型白酒大曲中分离得到产酱香风味的菌株，分析其发酵过程中的代谢产物，跟踪检测代谢过程中总酸、氨基酸态氮、还原糖的变化过程，并应用固相微萃取及气质联用技术检测其发酵后的挥发性物质，进而对产酱香芽孢杆菌的代谢产物进行研究，为找出酱香的主体香分提供了参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种来源

实验菌株：产酱香芽孢杆菌(从四川某酒厂产酱香高温大曲中筛得)。

1.1.2 主要仪器

SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；QYC-2102C型摇床 上海福玛实验设备有限公司；LRH-250型生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；6890N-5979B型气相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、琼脂22 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃，0.1 MPa，灭菌30 min。

发酵培养基：小麦150 g，一半打碎，另一半完整混匀后于150 mL蒸馏水中煮25 min，以100 g重量分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌30 min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

采用无菌操作将3株纯种菌株分别接种在斜面培养基上，37 ℃培养24 h，备用。

1.2.2 产酱香菌株固体发酵

用无菌生理盐水制成菌悬液，以2%接种量加入至发酵培养基中，共计3组平行实验。每隔24 h观察发酵情况，待发酵144 h完成后，对每个菌株产酱香情况做感官鉴定，根据产香能力分为：无、+、++、+++、 ++++ 5个等级，检查培养基的产香情况、褐变情况以及培养基粘性，并做好记录。

1.2.3 总酸含量的测定[10]

1.2.3.1 测定方法

分别取发酵时间24，48，72，96，120，144 h的样品10.0 g于研钵中，加入10.0 mL蒸馏水研磨均匀，定容后过滤，用氢氧化钠标准液滴定，记下消耗氢氧化钠标准液的体积，计算总酸含量。

1.2.3.2 结果计算

总酸度/(mol/mL)=(c×V×K)/V0。

式中：c为氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/mL；V为滴定所消耗的标准碱液的体积，mL；V0为滴定时吸取的样液体积，mL；K为换算系数。

1.2.4 氨基酸态氮的测定1.2.4.1 测定方法

采用甲醛法检测样品中的氨基酸态氮，根据消耗氢氧化钠标准液的量，计算出氨基酸态氮含量。

1.2.4.2 结果计算

氨基酸态氮/%=[(V1-V2)×c×0.014×100]/(m×10/100)。

式中：V1为稀释液在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氢氧化钠标准溶液的体积；V2为空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氢氧化钠标准溶液的体积；c为氢氧化钠标准溶液的浓度；m为样品的质量；0.014为氮的毫摩尔质量。

1.2.5 还原糖的测定[11]

1.2.5.1 样品处理

分别取发酵时间24，48，72，96，120，144 h的样品10.0 g，加入100 mL蒸馏水，搅拌20 min，静置10 min，取上清液即为样品液。

1.2.5.2 试样测定

采用斐林试剂鉴定还原糖的方法，直接滴定样品中的还原糖，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。

1.2.5.3 结果计算

η/%=250M2/(V0×V×1000)。

式中：η为样品中还原糖的含量(以葡萄糖计)；M2为10 mL碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各5 mL)相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量；V0为样品体积；V为测定时平均消耗样品溶液体积；250为样品溶液总体积。

1.2.6 GC-MS检测发酵产物[12]

1.2.6.1 样品预处理

分别取未接种菌株的空白发酵培养基、3种菌株各自发酵完成后的样品5 g于顶空瓶中平衡10 min后吸附20 min，将萃取头移入气相色谱的高温汽化室中解吸5 min，进行GC-MS分析。

1.2.6.2 GC-MS条件

色谱、质谱条件以及定性与定量分析方法参照《柑橘果皮中生香酵母的筛选及挥发性香气成分分析》中的检测条件和方法。

2 结果与分析

2.1 发酵后感官分析

发酵后观察小麦固体发酵培养基褐变、粘稠情况以及生香情况，前48 h有猪肉香味，略带氨味，到72 h有微弱的酱香味，氨气味消失，到96 h酱香味更突出，到120 h酱香味非常突出，144 h后酱香味浓郁，见表1。

表1 各菌株发酵144 h后培养基特征与产酱香情况

2.2 总酸含量测定

本次实验采用食品中总酸测定的普遍方法，即电位滴定法作为样品总酸测定的方法，计算总酸的含量，结果见图1。

图1 发酵过程中总酸的变化

由图1可知，随着发酵时间的增加，总酸含量也在不断增加，且都在发酵72 h后总酸突然增大，发酵后期总酸增速小，基本平稳略呈下降趋势。分析此变化过程，芽孢杆菌在发酵过程中产生大量有机酸，致使发酵产物中总酸含量增加，尤其在发酵第3天，发酵温度升高后明显增加，发酵后期一些碱性物质的生成导致总酸增速放慢，酸度有所下降。有研究表明，产酱香芽孢杆菌通常在高温下能更好地产香，其与美拉德反应有关，而产酱香芽孢杆菌的酸度突然增加也在发酵温度升高时，与生香情况一致。因此，酸度的变化与酱香的生香情况可能有密切关联。

2.3 氨基酸态氮的测定

氨基酸态氮含量的测定采用甲醛法，通过计算可得到样品中氨基酸态氮的含量，结果见图2。

图2 发酵过程中氨基酸态氮的变化

由图2可知，随着发酵时间的增加，氨基酸态氮含量不断增加，芽孢杆菌发酵产蛋白酶，蛋白酶能将蛋白质水解为氨基酸，随着发酵时间的推移，氨基酸态氮含量持续上升。在发酵过程中，蛋白质分解速度与酶的活力、蛋白质含量有密切关系，至发酵结束时氨基酸态氮含量达到最大。氨基酸态氮含量变化体现了游离氨基酸含量的逐渐增加，而游离氨基酸的含量与酱香食品的风味密切相关。

2.4 还原糖的测定

用直接滴定法测定食品中还原糖的含量，结果见图3。

图3 发酵过程中还原糖的变化

由图3可知，随着发酵时间的增加，还原糖的含量在不断减少，期间，芽孢杆菌将还原糖分解利用供其生长繁殖，最终发酵样品中的还原糖经过呼吸作用被全部分解利用，而经过微生物的糖代谢途径，更易产生多种中间代谢产物及最终代谢产物，进而为酱香风味提供了支撑。

2.5 GC-MS检测发酵产物

分别检测未接种菌株的空白发酵培养基、3种菌株各自发酵144 h后的挥发性物质，得到各样品的总离子流图谱，见图4～图7。对总离子流图中各数据进行分析，得到各样品中挥发性香气成分及相对含量，见表2。

图4 空白组香气成分图谱

图5 Q1香气成分图谱

图6 Q2香气成分图谱

图7 Q5香气成分图谱

表2 4种样品挥发性香气成分

由表2可知，3株菌株产挥发性物质有相同的，也有各自独特的。Q1产挥发性物质最多，达到12种，Q2为9种，Q5为10种。Q1吡嗪相对含量为43.18%，Q2吡嗪相对含量为50.46%，Q5吡嗪相对含量为45.96%，且Q1、Q2 产生的2,3,5,6-四甲基吡嗪相对含量较高，而Q5产生的2,5-二甲基吡嗪相对含量较高。吡嗪含量高低以及所含种类差异是导致所产酱香味不同的原因。

3 结论与讨论

酱香型白酒的主体香气成分一直是白酒行业的研究热点，到目前为止，关于酱香型白酒的特征香气成分在学术界仍没有定论。酱香主体香成分的不确定使得研究思路从源头上被限制了。因此，从产酱香细菌的角度来看，分析酱香型白酒的主要呈香物质及其形成机制值得进一步深入研究。

本文以小麦为发酵培养基，跟踪检测3株产酱香菌株在发酵过程中总酸、氨基酸态氮、还原糖的变化，得到其总酸含量是一个先增后降的变化过程，氨基酸态氮是一个连续增加的过程，而还原糖则是一个连续降低的过程。用固相微萃取及气质联用法检测3株菌株发酵后的挥发性物质，结果显示：其均有高含量、种类不同的吡嗪，以此可为确定产酱香主体成分提供参考。