下调miR-372靶向调控BTG1表达对胶质瘤细胞分泌免疫抑制因子的影响

苏保寿 薛治乾 余鹏飞 吴益敏 喻闻庆

(儋州市人民医院 1神经外科，海南 儋州 571799；2病理科)

胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，具有预后差、易复发等特点〔1〕。研究表明，免疫逃逸是肿瘤恶性进展的重要原因，肿瘤细胞分泌合成的免疫抑制因子如转化生长因子(TGF)-β1、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-8是诱导肿瘤细胞免疫逃逸的基础〔2〕。miRNA具有功能多样的特点，分别在不同的组织及生理进程中发挥作用，与多种细胞的生长、运动、能量代谢等有关〔3〕。研究显示，miRNA与肿瘤的发生密切相关，其不仅参与肿瘤细胞的恶性表型的转变过程，还与肿瘤的免疫逃逸有关，研究miRNA在肿瘤中的作用对于肿瘤的治疗和阐明肿瘤分子发生机制具有重要意义〔4〕。miR-372参与肿瘤进程，在肺鳞癌、肝癌中的研究报道显示，miR-372作为一种肿瘤促进因子诱导癌细胞增殖，而在卵巢癌中发现miR-372作为一种抑癌基因发挥抗肿瘤作用〔5～7〕。在胶质瘤中的研究表明，miR-372表达上调与胶质瘤患者预后不良有关，并且下调miR-372可以抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移，诱导胶质瘤细胞凋亡，miR-372在胶质瘤进展中发挥类似癌基因的作用〔8,9〕。目前对于miR-372在胶质瘤细胞分泌免疫抑制因子中的作用还不明确。本实验探讨下调miR-372对胶质瘤细胞U251分泌免疫抑制因子TGF-β1、VEGF、IL-8的影响和靶向调控机制，为研究miR-372在肿瘤免疫逃逸中的作用提供参考，为靶向基因治疗胶质瘤提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 胶质瘤细胞U87、U251、SHG-44和正常星形胶质细胞NHA购自美国ATCC；IL-8含量检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；siRNA对照(control)、B细胞易位基因(BTG)1 siRNA由广州易锦生物技术有限公司构建；VEGF含量检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen；抑制剂(inhibitor)control、miR-372 inhibitor、模拟物(mimics)control、miR-372 mimics由上海吉玛制药技术有限公司合成；TGF-β1含量检测试剂盒购自上海纪宁实业有限公司；BTG1抗体购自美国Proteintech；野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告载体由湖南丰晖生物科技有限公司构建。

1.2miR-372在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中表达差异检测 收集胶质瘤细胞U87、U251、SHG-44和正常星形胶质细胞NHA，用Realtime PCR方法测定miR-372水平。以Trizol试剂提取细胞中的总RNA，按照如下体系合成cDNA，包括：1 μl的RNA、8 μl的RNase-free Water、2 μl的5×PrimersScript RT Master Mix，cDNA合成条件为：37℃孵育15 min，85℃孵育5 s；按照如下体系进行Realtime PCR，包括：5 μl的2×SYBR缓冲液、上下游引物各0.5 μl、1 μl的cDNA，添加双氧水(ddH2O)至25 μl。反应程序为：94℃孵育4 min；94℃孵育30 s；60℃孵育15 s；72℃孵育30 s，一共30个循环。内参U6引物：正义链-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；反义链-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；miR-372引物：正义链-CAACAGAAGGCTCGAGCAACCTGCGGAGAAGATAC；反义链-TTCTGATCAGGATCCCATTACAGCCAGACGCTGTAAG。用2-△△Ct法分析miR-372水平。

1.3细胞转染和下调效果检测 胶质瘤细胞U251分成Control组、Anti-NC组、Anti-miR-372组，Anti-NC组、Anti-miR-372组分别为使用Lipofectami-ne2000转染inhibitor control、miR-372 inhibitor的细胞，Control组为没有转染的细胞。细胞转染步骤完全按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行。细胞转染后48 h，收集细胞，按照1.2中Realtime PCR方法测定下调效果。

1.4下调miR-372对胶质瘤细胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的影响检测 使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TGF-β1、VEGF、IL-8水平。收集培养48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-372组细胞培养液上清，分别使用TGF-β1、VEGF、IL-8含量测定试剂盒检测上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平，步骤完全按照试剂盒操作说明进行。

1.5miR-372靶基因预测和鉴定 生物信息学软件targetscan预测miR-372的靶基因，结果发现BTG1的3'UTR端与miR-372有互补结合位点，使用荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将WT和MUT荧光素酶报告载体分别同mimics control、miR-372 mimics共转染到胶质瘤细胞U251中，培养48 h以后，用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。WT荧光素酶报告载体含有BTG1的3′UTR端结合位点，MUT荧光素酶报告载体含有突变以后的BTG1的3′UTR端结合位点。

1.6下调miR-372对胶质瘤细胞中BTG1蛋白表达影响检测 收集培养48 h以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-372组细胞，分别添加0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，然后在每个孔中添加200 μl的裂解溶液，用细胞刮刀收集裂解液，放在冰上裂解30 min。收集上清(蛋白上清)，添加到上样缓冲液中混合，100℃煮沸5 min。上样(每孔上样30 μg)，在上层胶中使用90 V电泳，在下层胶中使用120 V电泳。以300 mA电流转膜1 h。将硝酸纤维素(NC)膜放在封闭液中孵育1.5 h。把NC膜放在一抗反应液中，在4℃过夜。NC膜放在HRP标记的二抗稀释液中，置于室温中孵育1 h。电化学发光(ECL)显色。用Image J分析条带的灰度值，GAPDH作为内参，分析BTG1蛋白水平。BTG1一抗稀释倍数为1∶1 000，二抗稀释倍数为1∶2 000，抗体均用封闭液稀释，封闭液为5%牛血清白蛋白的TBST。

1.7BTG1 siRNA对下调miR-372影响胶质瘤细胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的作用检测 胶质瘤细胞中BTG1分别共转染miR-372 inhibitor、siRNA control和miR-372 inhibitor、BTG1 siRNA，记为Anti-miR-372+si-NC组、Anti-miR-372+si-BTG1组，细胞培养48 h以后，收集细胞和培养液上清，ELISA方法测定培养液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平，Western印迹检测细胞中BTG1蛋白表达，步骤同上。

1.8统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-372在胶质瘤细胞中表达上调 胶质瘤细胞U87(1.85±0.12)、U251(2.36±0.27)、SHG-44(1.64±0.15)中miR-372表达水平高于正常星形胶质细胞NHA(1.00±0.09)，胶质瘤细胞U87、SHG-44中miR-372表达水平显著低于胶质瘤细胞U251。miR-372在胶质瘤细胞中表达上调。选用胶质瘤细胞U251做后续实验。

2.2miR-372 inhibitor下调胶质瘤细胞U251中miR-372表达水平 在胶质瘤细胞U251中转染miR-372 inhibitor，细胞中的miR-372表达水平显著下降，见表1。

2.3下调miR-372提高胶质瘤细胞U251中BTG1蛋白表达 在胶质瘤细胞U251中转染miR-372 inhibitor，细胞中BTG1蛋白水平显著升高，见表1和图1。

表1 miR-372 inhibitor转染后胶质瘤细胞U251中miR-372及BTG1蛋白水平比较

图1 Western印迹检测miR-372 inhibitor转染后胶质瘤细胞U251中的BTG1蛋白表达

2.4下调miR-372抑制胶质瘤细胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8 在胶质瘤细胞U251中转染miR-372 inhibitor，细胞培养液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平显著下降，见表2。

表2 miR-372 inhibitor转染后胶质瘤细胞U251培养液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平

2.5miR-372靶向调控BTG1蛋白表达 生物学信息学软件发现miR-372与BTG1的3′UTR端结合位点，通过荧光素酶报告系统鉴定发现BTG1受到miR-372的靶向调控作用，见图2和表3。

图2 miR-372与BTG1的3′UTR端结合位点

表3 荧光素酶活性

2.6BTG1 siRNA逆转下调BTG1抑制胶质瘤细胞U251分泌TGF-β1、VEGF、IL-8 与共转染miR-372 inhibitor和siRNA control的细胞比较，共转染miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA后的胶质瘤细胞U251培养液上清中TGF-β1、VEGF、IL-8水平显著升高，细胞中BTG1蛋白表达水平显著下降，见图3和表4。

1～2：Anti-miR-372+si-NC组、Anti-miR-372+si-BTG1组图3 Western印迹检测miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA共转染后胶质瘤细胞U251中BTG1蛋白水平

表4 miR-372 inhibitor和BTG1 siRNA共转染后胶质瘤细胞U251中BTG1蛋白水平和分泌TGF-β1、VEGF、IL-8水平

3 讨 论

miRNA是近些年来发现的单链RNA，目前已经发现有超过1 000多种miRNA，miRNA可以通过特异性的识别靶标进而调控靶mRNA的表达〔10〕。研究表明，miRNA与肿瘤的进展有关，在肿瘤发生中发挥类似癌基因或者是抑癌基因的作用，miRNA参与肿瘤细胞恶性生物学行为及肿瘤免疫逃逸过程〔11，12〕。miR-372是目前发现的与肿瘤进展关系十分密切的调节因子，其参与肿瘤细胞恶性增殖、转移等过程，并且在不同的肿瘤中的作用不同〔13〕。在白血病、肺癌、肝癌等肿瘤患者中发现miR-372表达上调，miR-372具有促进肿瘤细胞恶性进展作用，下调miR-372表达抑制肿瘤转移和生长〔5，6,14〕。在卵巢癌中的研究表明，miR-372可以下调卵巢癌细胞的转移和上皮间充质转化(EMT)能力，miR-372在卵巢癌中扮演抑癌基因的作用〔7〕。研究显示，miR-372在胶质瘤组织中高表达，其可以促进胶质瘤细胞的恶性生长和转移，miR-372表达上调与胶质瘤患者预后差有关〔8，9〕。本实验显示，miR-372在胶质瘤细胞中的表达水平明显升高，这与之前的研究结果相符合，均提示miR-372在胶质瘤中高表达，miR-372在胶质瘤中发挥类似癌基因的作用。

肿瘤免疫逃逸是近些年来研究的热点，肿瘤细胞能够合成并分泌多种细胞因子促进肿瘤进展和转移〔15〕。TGF-β1、VEGF、IL-8是肿瘤发生过程中的促进因子，能够诱导肿瘤免疫逃逸发生，其在肿瘤组织中表达水平异常升高〔16，17〕。本研究显示，下调miR-372后的胶质瘤细胞分泌的TGF-β1、VEGF、IL-8减少，提示下调miR-372可以抑制胶质瘤细胞分泌免疫抑制因子，miR-372可能通过参与肿瘤免疫逃逸过程介导肿瘤进展。

miRNA是一种新型的基因调节剂，其可以调控mRNA的表达发挥生物学作用〔18〕。miRNA通过影响不同的靶mRNA的翻译而调控机体发育，并且同一个miRNA可以通过影响不同的靶基因表达而发挥不同的生物学作用〔19，20〕。本实验显示，miR-372靶向调控胶质瘤细胞中BTG1表达，BTG1可能是miR-372影响胶质瘤进展的机制之一。BTG1属于BTG/Tob家族成员之一，其是在研究B型淋巴细胞白血病中发现的，BTG1具有抗细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，与很多肿瘤如肝癌、胃癌、胰腺癌等的发生及发展密切相关，BTG1在肿瘤进展中发挥类似抑癌基因的作用〔21～23〕。在胶质瘤中研究显示，BTG1可以作为一种抑癌基因成为胶质瘤治疗的靶点〔24〕。本实验结果表明，下调BTG1可以抑制下调miR-372对胶质瘤细胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-8的抑制作用，提示下调miR-372通过靶向调控BTG1表达参与胶质瘤细胞分泌免疫抑制因子过程。

综上，miR-372在胶质瘤免疫逃逸中可能发挥促进作用，下调miR-372抑制胶质瘤细胞分泌免疫抑制因子，其作用机制与靶向调控BTG1的表达有关。在以后研究中会继续探讨miR-372在肿瘤中的调控网络和机制。