长链非编码RNA UCA1通过靶向调控miR-613进而调控乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

陆小琴 牛司强 毛素芳

(1雅安职业技术学院药学与检验学院，四川 雅安 625000；2重庆医科大学附属第一医院检验科；3隆昌市人民医院药剂科)

乳腺癌是严重威胁我国妇女健康的恶性肿瘤，疾病负担日益加重，其具体的发病机制仍不清楚〔1〕，因此寻找新的治疗方案及作用靶点对乳腺癌的预防和治疗具有重要的临床意义。长链非编码RNA(LncRNA)是指长度大于200 bp的不编码蛋白的RNA，近些年来发现它与肿瘤的发生发展有一定关系〔2〕。LncRNA在肿瘤中异常敏感，可作为肿瘤诊断的特异标记物〔3〕。在乳腺癌的研究中，LncRNA多为促癌因子，较少一部分为抑癌因子，研究LncRNA的作用和分子机制，将为乳腺癌的诊断和治疗提供新靶点和新思路〔4〕。尿路上皮癌胚抗原(UCA)1 最初是在膀胱癌中发现并命名的一种长链非编码RNA〔5〕。研究发现UCA1在膀胱癌〔6〕、乳腺癌〔7〕、黑色素瘤〔8〕等多种肿瘤中表达异常，能够通过调控信号通路或作为竞争性内源RNA(ceRNA) 影响肿瘤的发生发展及对化疗药物的敏感性〔9〕。

miRNA是一类转录后表达调控的非编码小分子RNA，调控细胞的发育、分化，是潜在的肿瘤分子标志物，在肿瘤的早期诊断、治疗、预后判断及化疗耐药中都有良好的应用前景〔10〕。miRNA在肺癌〔11〕、乳腺癌〔12〕和前列腺癌〔13〕等多种肿瘤中差异性表达显著。miR-613可作为卵巢癌〔14〕、食管鳞状细胞癌〔15〕预后标志物。本研究将探寻LncRNA UCA1通对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响，分析UCA1和miR-613的靶向关系。为寻找有效生物靶标、实现乳腺癌的精准治疗提供一定实验基础。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人乳腺上皮细胞株HBL-100和人乳腺癌细胞MDA-MB-231均购于中科院细胞库。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司；Trizol、LipofectamineTM2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；MTT试剂盒购自碧云天公司；载体质粒由上海生工公司构建；细胞板、酶标仪购自Bio-Rad公司。

1.2细胞培养 人乳腺上皮细胞株HBL-100和人乳腺癌细胞MDA-MB-231常规培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，置于37℃，含5% CO2恒温箱培养。每2～3 d传代一次。

1.3细胞转染和分组 取常规培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231消化后接种于6孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。转染分为空转染(si-con)组、抑制转染(si-UCA1)组、空转染(miR-con)组、过表达转染(miR-613)组(转染miR-613 mimics)、空转染(pcDNA)组、过表达转染(pcDNA-UCA1)组、si-UCA1+anti-miR-con组、si-UCA1+anti-miR-613组，转染按照LipofectamineTM 2000试剂盒进行操作。

1.4qRT-PCR分析UCA1及miR-613表达水平 按照Trizol说明书提取总RNA，用反转录试剂盒逆转录成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR® Green Mix说明书进行qRT-PCR方法扩增。循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.5MTT法测定抑制表达UCA1、过表达miR-613和miR-613抑制表达逆转si-UCA1对MDA-MB-231细胞增殖的影响 分别取si-con组、si-UCA1组、miR-con组、miR-613组、si-UCA1+anti-miR-con组和si-UCA1+anti-miR-613组的对数生长期细胞消化后，接种于96孔板(5×103个/孔)培养，分别于24 h、48 h和72 h培养时间点，每孔加入20 μl(5 g/ L)的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)振荡反应10 min，酶标仪测定各孔490 nm波长处光密度(OD)值。每组设3个复孔取均值，另设单孔只加培养基作空白对照。以上实验重复3次。

1.6Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 收集si-con组、si-UCA1组、miR-con组、miR-613组、si-UCA1+anti-miR-con组和si-UCA1+anti-miR-613组稳定表达的MDA-MB-231细胞，无血清培养基制细胞悬液，接种于 Transwell 小室上层(3×103个/孔)。Transwell小室风干后，加入500 μl 0.1%结晶紫染色，显镜下拍照并计数发生迁移的细胞数量。细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入50 μl 2.0 mg/ml基质胶，凝固后接种MDA-MB-231细胞，之后同细胞迁移操作。倒置显微镜下随机选取5个视野进行细胞的计数，重复3次。

1.7荧光素酶报告基因检测实验检测UCA1对miR-613的转录调控 TargetScan数据库显示UCA1 3′UTR区域有miR-613结合位点。构建野生型和突变型基因靶点UCA1的3′UTR-荧光素酶表达载体(WT-UCA1和MUT-UCA1)，取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于24孔板(5×104个/孔)，待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000分别共转染WT-UCA1与miR-613 mimics或miR-con、MUT-UCA1与miR-613 mimics或miR-con。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析。实验重复3次。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1UCA1和miR-613在人乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达 与HBL-100细胞相比，MDA-MB-231细胞中UCA1的表达水平显著升高，miR-613表达水平显著下降(均P<0.001)。见表1。

2.2抑制UCA1表达对乳腺癌细胞增殖的影响 与si-con组相比，在48 h和72 h时si-UCA1组MDA-MB-231细胞活性显著降低(P<0.05)。可见，抑制UCA1表达可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖。见表2。

表1 UCA1和miR-613在HBL-100细胞和MDA-MB-231细胞中的表达

表2 抑制UCA1表达对乳腺癌细胞增殖的影响

2.3抑制UCA1表达对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响 与si-con组比较，si-UCA1组乳腺癌细胞迁移和侵袭数量显著降低(均P<0.001)。可见，抑制UCA1表达可抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。见表3、图1。

表3 抑制UCA1表达对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响

图1 抑制UCA1表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响(Transwell,×200)

2.4过表达miR-613对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响 与miR-con组比较，miR-613组乳腺癌细胞在48 h和72 h时细胞活性显著降低(P<0.05)。与miR-con组比较，miR-613组乳腺癌细胞迁移和侵袭数量显著降低(均P<0.001)。可见，过表达miR-613可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。见图2、表4。

图2 过表达miR-613对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响(Transwell，×200)

表4 过表达miR-613对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.5UCA1靶向调控miR-613的表达 通过TargetScan数据库预测到UCA1与miR-613存在结合位点(图3)。荧光素酶报告基因检测实验结果(表5)显示，共转染WT-UCA1与miR-613 mimics的细胞的荧光素酶活性显著低于共转染WT-UCA1与miR-con的细胞(P<0.01)，而共转染MUT-UCA1与miR-613 mimics的细胞荧光素酶活性与共转染MUT-UCA1与miR-con的细胞比较差异不显著。相较于si-con组(0.49±0.06)，si-UCA1组(1.17±0.12)乳腺癌细胞中miR-613的表达水平显著升高；而相较于pcDNA组(0.53±0.06)，pcDNA-UCA1组(0.19±0.03)乳腺癌细胞中miR-613的表达水平显著降低(P<0.05)。可见，UCA1是miR-613的靶基因。

图3 UCA1的3′UTR中含有与miR-613互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-613表达逆转了抑制UCA1表达对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的作用 在48 h和72 h时，与si-con组比较，si-UCA1组MDA-MB-231细胞活性显著降低；而与si-UCA1+anti-miR-con组比较，si-UCA1+anti-miR-613组MDA-MB-231细胞活性显著升高(P<0.05)。与si-con组比较，si-UCA1组MDA-MB-231细胞迁移和侵袭数显著降低；而与si-UCA1+anti-miR-con组比较，si-UCA1+anti-miR-613组MDA-MB-231细胞迁移和侵袭数显著升高(P<0.01，P<0.001)。见图4、表6。可见，抑制miR-613表达可逆转抑制UCA1表达对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

图4 抑制miR-613表达逆转了抑制UCA1表达对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的作用(Transwell,×200)

表6 抑制miR-613表达逆转了抑制UCA1表达对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的作用

3 讨 论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，肿瘤的转移是造成乳腺癌死亡的主要原因〔16〕。研究发现LncRNA在肿瘤诊断和治疗方面具有良好的临床应用前景，将成为新型肿瘤诊断标志物和肿瘤治疗的靶点〔17〕。LncRNA在乳腺中异常表达、功能失调，导致正常乳腺功能的异常改变，是乳腺肿瘤形成的重要因素，与它的转移有关〔18〕。UCA1是一种LncRNA，UCA1水平在人类原发性乳腺肿瘤中显著增强，敲低UCA1可抑制蛋白酶B(AKT)磷酸化，消除巨噬细胞诱导的肿瘤细胞的侵袭性〔19〕。UCA1在膀胱癌中高表达，且负向调节miRNA-99b〔20〕；UCA1对膀胱癌有高度特异性和敏感性，可作为诊断其标记物〔21〕。LncRNA在胃癌中异常高表达，下调UCA1可明显抑制胃癌细胞增殖〔22〕。在食管癌组织中UCA1差异下调表达，或参与食管癌发生发展〔23〕。UCA1在肝癌转移过程中高表达，可作为肝癌转移诊断和病情监测的标志物〔24〕。UCA1在结肠癌中上调表达，与结肠癌的进展及患者的不良预后密切相关〔25〕。UCA1在胰腺癌组织中高表达，沉默UCA1可抑制胰腺癌细胞的体外迁移和侵袭〔26〕。

miRNA与LncRNA相互作用共同调控肿瘤进展〔27〕，与患者临床预防、诊疗及预后密切相关〔28〕。最新研究表明miRNA与乳腺癌的侵袭和转移密切相关，miR-10b〔29〕、miR-373和miR-520c〔30〕促进乳腺癌细胞的侵袭与转移，miR-335和miR-126〔31〕则抑制乳腺癌的转移。miRNA-613在甲状腺乳头状癌组织中低表达，与其侵袭性相关〔32〕。miR-613通过靶向形态发生紊乱关联激活因子1/RAS同源基因家族成员A(Daam1/RhoA)信号传导途径参与三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭〔33〕。miR-613通过靶向脑源性神经营养因子(BDNF)抑制胃癌肿瘤细胞增殖，迁移和侵袭，是它的潜在治疗靶标〔34〕。miR-613在肝细胞癌中显著低表达，与预后不良有关〔35〕。miR-613通过靶向Frizzled7抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭〔36〕。miR-613通过调节SphK2抑制乳头状甲状腺癌的细胞生长，迁移和侵袭〔37〕。

UCA1与miRNA之间相互作用可以调控相关肿瘤的发生发展。UCA1通过竞争性抑制miR-18a增强乳腺癌细胞的他莫昔芬治疗耐药〔38〕。UCA1通过阻止miR-18a抑制YAP1使乳腺癌细胞对曲妥珠单抗脱敏〔39〕。UCA1通过与p27 mRNA竞争异质性细胞核核糖核蛋白(hnRNP)I来抑制p27蛋白水平而促进乳腺肿瘤生长〔7〕。在膀胱癌细胞中UCA1负向调节miRNA-99b的表达〔40〕。miR-216b在体外培养细胞中加速UCA1的降解〔41〕；上调的UCA1通过抑制miR-216b和激活成纤维细胞生长因子受体1/细胞外信号调节激酶(FGFR1/ERK)信号通路促进肝细胞癌的进展〔42〕。

本研究发现，miR-613在乳腺癌MDA-MB-231细胞中呈现低表达，说明其可能参与调控结肠癌的发生发展。通过转染miR-613 mimics研究了miR-613对结肠癌乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的影响，结果显示过表达miR-613可以抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在MDA-MB-231细胞中同时转入si-UCA1和miR-613抑制表达质粒，可逆转si-UCA1的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

综上所述，LncRNA UCA1可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与靶向miR-613有关，为乳腺癌的靶向治疗提供新靶点。