PDIA4基因沉默对胶质瘤细胞凋亡的影响

朱传华，谢琳，刘安民

胶质瘤是神经中枢系统最常见的原发恶性肿瘤，且传统手术、化疗、放疗及目前已有的靶向治疗对胶质瘤的治疗效果不佳。目前对于胶质瘤的病因仍不清楚，因此探讨其发病机制对于胶质瘤的诊疗具有重要意义［1］。蛋白二硫键异构酶家族成员4（protein disulfide isomerase family a member 4，PDIA4）定位于细胞内质网发挥功能，参与蛋白质折叠、硫醇-二硫键交换反应和内质网应激反应。近些年来越来越多研究表明，PDIA4基因是肿瘤诊断和治疗的潜在靶标［2］，但其在胶质瘤发生发展中的作用机制不明。本研究利用RNAi技术沉默PDIA4表达，探索其对胶质瘤增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象

人胶质瘤细胞系U251、U87、HA1800由中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心提供。DMEM高糖培养基、胎牛血清、细胞用青霉素/链霉素和EDTA胰酶购自美国Gibco公司；星形胶质细胞培养基购自ScienCell公司；alarma blue试剂购于Sigma公司；LipofectamineTM3000、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Invitrogen公司；RNA-Quick Purification Kit购自上海奕杉生物；cDNA Synthesis SuperMix和SYBR Green Master Mix购自上海翊圣生物；4%多聚甲醛、结晶紫染液购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白提取RIPA裂解液购自康为世纪公司；cleaved-caspase-3、cleavedcaspase-7单克隆抗体、羊抗兔二抗购自CST公司。引物由苏州泓迅生物科技公司合成，靶向PDIA4的小干扰RNA及阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司，siRNA序列：si-PDIA4#768 5′-GCAAGCGUUCUCCUCCAAUTT-3′，si-PDIA4#1829 5′-GCCUGGUCAUCGCCAAGAUTT-3′，siNC 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

1.2 CGGA数据库分析

从CGGA（中国脑胶质瘤基因组图谱计划）网 站（http：//cgga.org.cn/）下 载mRNAseq_693［3］和mRNAseq_325［4］的RNAseq数据及相应临床数据，使用R语言的“sva”和“limma”包进行批次校正，应用kruskal检验分析基因表达量和肿瘤级别的相关性，利用“survival”和“survminer”u语言包进行生存分析并作图，基因高表达组和低表达组通过中位值划分。……