MiR-146a介导依那西普对强直性脊柱炎活动期患者炎症因子和骨代谢的影响

直彦亮，林思薪，贺 宪，张 震

（1.广州市番禺区中医院，广东广州 511400；2.深圳市中西医结合医院，广东深圳 518104）

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS) 是发病率较高的一类自身免疫性疾病，主要导致脊柱和关节化强直[1]，是AS 患者残疾的主要病理因素。目前临床上对AS常采用非甾体抗炎药和生物制剂进行治疗[2]。依那西普(Etanercept)是一类肿瘤坏死因子拮抗剂，通过拮抗TNF-α 表达，抑制炎症，起到治疗AS 的作用[3]。研究表明微小RNA(MicroRNA，miRNA)在成骨细胞和破骨细胞发生发展中发挥重要作用，调控骨形成、骨吸收和骨重塑等过程[4]。Wnt/β-catenin经典信号通路在成骨过程中发挥重要作用，可促进成骨细胞生成的主要通路。OPG/ RANKL/ RANK信号通路是细胞调节骨代谢平衡的关键系统[5]。RANKL 与RANK 结合后，激活RANK 和NF-κB，进而引发破骨细胞基因转录，促进破骨细胞形成分化成熟。而OPG 在破骨细胞外与RANKL 竞争性结合，使RANK 失活，抑制破骨细胞分化和破骨细胞活性，阻碍骨吸收[6]。OPG、RANKL、RANK 三者相互作用，共同构成了调节骨代谢平衡的OPG/RANKL/RANK 系统。miR-146a 可以抑制炎症发生，并且可能成为AS的一种诊断生物学标志[7]。而依那西普是否与miR-146a存在关系，以及miR-146a对骨代谢以及Wnt/βcatenin、OPG/RANKL/RANK 信号通路是否有影响，均未有相关研究报道。本研究拟通过研究依那西普对强直性脊柱炎小鼠miR-146a 表达的影响，以及依那西普和miR-146a对炎症因子、骨代谢的影响，为深入了解依那西普生物学机制及治疗靶点提供支持。

1 研究对象及材料

1.1 研究对象

以56 例AS 活动期患者与45 只鼠龄4～5 周的雄性健康BALB/c 小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）作为研究对象。

AS 活动期患者选自2017 年1 月-2018 年12 月期间在广州市番禺区中医院住院诊治的病例，其中男30例，女26例，年龄21～67岁，平均41.24±10.4岁；病程0.3～30 年，平均14.27±7.72 年。采用随机数字表法将56 例AS 患者分为依那西普组和柳氮磺吡啶(sulfasalazine，SASP) 组，各28 例，2 组患者在年龄、病程等方面差异均无明显区别，具有可比性。

纳入标准：①强直性脊柱炎评估组织(Assessment of in Ankylosing Spondylitis，ASAS)发布的中轴型脊柱关节炎(axial spondyloarthritis，SpA) 分类标准[8]；②入组前接受化学药物或生物药物治疗。排除标准：①妊娠、哺乳期和近期计划受孕患者；②严重关节畸形疾病；③有严重肝肾功能障碍者。所有研究对象签署知情同意书并经医院伦理委员会批准后执行。

1.2 主要试剂及仪器

酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、总RNA提取试剂（Invitrogen 公司）；蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、兔抗鼠酶标二抗（碧云天生物）；鼠抗人单克隆抗体Wnt、β-catenin、RANKL、RANK、OPG（CST 公司）；lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen 公司）；反转录试剂盒和TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR 试剂盒（大连宝生物公司）；miR-146a、U6 引物（上海生工生物）。Applied Biosystems 7500仪器、Bio-Rad凝胶成像分析仪（美国伯乐）；全自动血液分析仪（迈瑞医疗）。

1.3 研究方法

1.3.1 对患者的治疗方法以及相关检测

治疗方法：依那西普组给予依那西普(辉瑞制药有限公司，批号：506005，规格：25 mg)皮下注射，25 mg/次，每周2 次，治疗3 月；SASP 组服用SASP(上海三维制药有限公司，国药准字H31020450，批号：20140420，规格：0.25 g/片)，4片/次，2次/d，治疗3月。

RT-qPCR 检测：Trizol 法提取血清RNA。用Taq-Man@MicroRNA Reverse Transcription kit 进行反转录，反应总体系为10 μL。用TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR 试剂盒检测miR-146a 表达，以U6作为内标，miR-146a 上游引物5′-CAGCTGCATTGGATTTACAA-3′;下游引物5′-GCCTGAGACTCTGCCTTCTG -3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，70bp；下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，94bp。SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒检测FOXO1 mRNA 表达，每组设3 个重复，根据△△CT 法对结果进行相对定量分析，根据各样本的平均CT 值，以2-ΔΔCt 表示mRNA 相对表达水平，所有反应均在ABI7500实时定量PCR仪完成。

1.3.2 动物造模、处理及分组

45 只4～5 周的雄性健康BALB/c 小鼠，适应性喂养1周后，进行造模(蛋白聚糖+弗氏佐剂造模)，造模成功表现为四肢足趾部红肿[9]。将造模后的小鼠分为5组：①模型对照组；②依那西普组，剂量0.5 mg/kg[10]，每天1 次；③miR-146a 抑制剂组，剂量80 mg/kg，每天1次（参考瑞博动物实验用量说明）；④依那西普+miR-146a 抑制剂组，同时给予依那西普0.5 mg/kg，miR-146a 抑制剂80 mg/kg，每天1 次；⑤Negtive Con组（miR-146a 抑制剂阴性对照组），给予无序miRNA80 mg/kg，每天1 次。每组9只，均为尾静脉注射。治疗4周后处死，获得血液和脊柱组织。

1.3.3 对小鼠相关指标的检测

检测指标：全自动血液分析仪检测小鼠CRP，双抗体夹心酶联免疫吸附（ABC-ELISA）法检测TNFα、IL-6、PTH、OPG、BALP、OC。

Western blot：参照王簕等[11]对骨组织总蛋白的提取方法，将小鼠脊柱剪碎后，用锤击加研磨法处理脊柱组织后，根据蛋白提取试剂盒说明提取小鼠脊柱组织总蛋白。BCA 试剂盒说明检测总蛋白量。根据目的蛋白分子量用合适浓度的SDS-PAGE 凝胶电泳分离，继而转膜和封闭，孵育一抗和二抗后，化学发光后进行采集图像。

1.3.4 统计分析

2 结果

2.1 两组患者miR-146a表达水平

通过荧光定量PCR 检测2 组患者血清miR-146a表达水平，结果显示，依那西普与SASP 治疗后2组患者血清miR-146a 表达水平明显下调，但依那西普治疗后更明显，差异具有显著性意义(P＜0.05)，见图1。

图1 依那西普与SASP治疗后对患者血清miR-146a表达水平的影响

2.2 miR-146a 转染对模型炎症因子及骨代谢生化指标影响

将miR-146a抑制剂注射至小鼠模型。观察炎症因子和骨代谢生化指标变化，结果显示，与模型对照组及Negative Con 组相比，依那西普、miR-146a 抑制剂显著降低炎症因子TNF-α，IL-6，CRP 和骨代谢指标BALP 血清水平，提高骨代谢生化指标OPG、OC、PTH 血清水平，且miR-146a 抑制剂+依那西普改善更为显著，与miR-146a 抑制剂组、依那西普组存在统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1 炎症因子和骨代谢生化指标

2.3 miR-146a转染对成骨通路和破骨通路蛋白影响

与Negative Con 组比，依那西普、miR-146a 抑制剂以及miR-146a 抑制剂+依那西普组均显著下调RANKL、RANK 蛋白表达，上调OPG、Wnt、β-catenin蛋白表达。见图2。

图2 蛋白表达变化

3 讨论

SA、SP 是治疗AS 的传统药物，通过其代谢产物水杨酸起到抗炎作用。近年来，依那西普广泛用于强直性脊柱炎治疗，因其能抑制炎症进程，缓解局部疼痛症状从而改善患者生活质量。在强直性脊柱炎患者中多种miRNA 分子异常表达，其机制之一是参与成骨、破骨及炎症过程[12]。

本研究首先发现依那西普组治疗后能显著降低miR-146a 表达水平，与对照组在明显差异(P＜0.05)。进一步研究发现依那西普和miR-146a抑制剂可以显著降低小鼠血清炎症因子TNF-α，IL-6，CRP 和骨代谢指标BALP 血清水平，提高骨代谢生化指标OPG、OC、PTH 血清水平，两者联合效果更为显著，推测依那西普可能是通过抑制miR-146a 表达，使得治疗效果叠加从而改善小鼠病情。后续的研究证明依那西普和miR-146a 抑制剂治疗后可促进成骨生成的Wnt、β-catenin 蛋白表达上调、抑制破骨细胞生成的OPG 蛋白上调，而促进破骨细胞生成的RANKL、RANK 破骨通路下调，差异具有显著性意义。上述结果表明伊那西普改善活动期AS患者的炎症反应和骨代谢的机制是通过miR-146a介导。依那西普可下调miR-146a 表达，这种调节作用可能通过促进成骨和抑制破骨，从而改善患者炎症因子和骨代谢。本研究为全面了解依那西普的治疗作用以及针对miR 分子开发潜在治疗手段提供支持。

综上所述，依那西普通过抑制强直性脊柱炎患者miR-146a 表达，进而通过促进调节成骨作用并抑制破骨等过程，从而改善患者炎症因子及骨代谢。在AS患者中有诸多miRNA 分子异常表达，本研究只研究了一种，不清楚依那西普对其它miRNA 的调节作用，在后续的研究中需要深入了解依那西普对其它miRNA的表达调控。