茶树精油的提取及抗耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌（MRSA）的活性研究

李炳霞，张 亮

（1.山东省潍坊市潍坊滨海经济技术开发区动物防疫监督所，山东 潍坊 262737； 2.山东方舟生物科技有限公司，山东 潍坊）

金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界中，是自然界分布最广泛的细菌之一，金黄色葡萄球菌的感染可以引起皮肤表面化脓，以及引起人畜共患的呕吐、咳嗽等症状，常侵染抵抗力低下的人畜机体，该菌株耐药性强，变异菌株感染常常不能得到快速有效的治疗，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphyloco-ccus aureus，MRSA），该菌株具有多重耐药性，且耐药产生的过程极短，成为了人畜共患的主要细菌之一[1]，在与细菌长期的抗争中，天然植物提取物的抗菌作用逐渐显现，其中茶树精油的抗菌效果极佳，对金黄色葡萄球菌有很好的抑制和杀灭作用，茶树精油（Teatreeoil）是从桃金娘科白千层属植物茶树中提取得到的淡黄色油状液体，具有特殊芳香气味，广泛分布于澳大利亚与新西兰的部分地区，目前我国福建、海南、云南及广西等地也有种植，茶树精油含有挥发油、鞣质、脂肪酸、萜类等100多种成分，其主要成分为松油烯-4-醇与1,8-桉叶素[2]。茶树精油具有非选择性的广谱抗菌活性，以膜破坏的形式发挥抗菌作用，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等都有较强的抑制作用[3]，茶树精油又是天然植物的提取成分，具有无毒害的特点[4]，在某些特定场景比抗生素更有优势，有望可以替代抗生素，为开发天然药物替代抗生素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

新鲜茶树枝叶（由山东方舟生物科技有限公司提供）；松油烯-4-醇标准品（北京索莱宝科技有限公司），1,8-桉叶素标准品（北京索莱宝科技有限公司），色谱级甲醇（国药集团化学试剂有限公司），色谱级正己烷，高纯度氮气、Agilent7890气相色谱分析仪（美国安捷伦公司）、KQ-100DE型数控超声波清洗仪、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），MH-A琼脂培养基、MH-B肉汤培养基（青岛海博生物技术有限公司）；MTT染液（北京索莱宝科技有限公司）；电热恒温培养箱（型号为DNP-9272A，购自上海鸿都电子科技有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（型号为LDZX-50KBS，购自上海申安医疗器械厂）；生物安全柜（型号为HF-safe，购自上海力申科学仪器有限公司）。

1.2 方法

采用水蒸气蒸馏法提取茶树精油，通过倍比稀释法测定茶树精油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用。

2 结果与分析

2.1 茶树精油有效成分含量测定

色谱条件：毛细管色谱柱Aligent DB-FFAP（30 m × 0.32 mm × 0.5 µm）氮 气；进 样 口230 ℃；检测器230 ℃；升温程序：50 ℃ 保持1 min，5 /min℃ 升至200 ℃，保持2 min，流速及模式1.3 ml/min，恒线速度；分流比50:1；进样量1 µl。样品色谱图松油烯-4-醇与1,8-桉叶素的保留时间一致。

以峰面积与纵坐标（Y），松油烯-4-醇、1,8-桉叶素对照品的质量浓度为横坐标（X）的标准曲线回归方程：松油烯-4-醇为Y=340.45X-8.1705（R2=0.9999）；1,8-桉叶素为Y=433.7X+ 0.2551（R2=0.9999）。

2.2 茶树精油的提取

热回流提取。称取100 g茶树枝叶，用剪刀剪成段状[5]，加入烧瓶中，按照1:10加入1 L纯化水，加热回流提取2 h，待精油液面不再变化，缓慢放液取出上层淡黄色油相层液体[6]，得茶树精油1.6 g，与标准品峰对比，茶树精油中的松油烯-4-醇与1,8-桉叶素保留时间一致[7]。

2.3 茶树精油主要成分薄层色谱鉴别

精密吸取提取到的茶树精油0.375 ml加入到5 ml容量瓶，乙酸乙酯定容。取松油烯-4-醇50mg和1,8-桉叶素10mg分别加入两个5 ml容量瓶中用乙酸乙酯定容备用。用点样器分别吸取提取到的茶树精油、松油烯-4-醇、1,8-桉叶素各2 µl点于含羧甲基纤维素钠的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（10:1）为展开剂，以2 %香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂，烘干加热至显色[8]，见图1。结果显示本次提取到的茶树精油与松油烯-4-醇、1,8-桉叶素标准品在色谱相对应的位置显示相同颜色的斑点。

图1 茶树精油（左）、松油烯-4-醇（中）、1,8-桉叶素（右）薄层色谱

2.4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）抑菌试验

2.4.1 菌液制备 在超净工作台中取出冻存的MRSA菌株，接种于MH-B液体培养基中，36 ℃ 恒温震荡培养24 h，培养完成后再接取一接种环划线接种至MH-A固体培养基中36 ℃ 恒温培养24 h。用接种环挑取单菌落于MH-B液体培养基中[9]，连续培养至16 h即可作为菌液使用。

2.4.2 最小抑菌浓度（MIC）测定 将培养至16 h的MRSA菌液转移至无菌操作台，用倍比稀释法测定最小抑菌浓度，通过生长对照、阴性对照，37 ℃ 恒温培养18 h。重复三次试验观察结果[10]。通过倍比稀释法测定茶树精油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用，当茶树精油浓度为0.75 % 时，该孔澄清，生长对照组浑浊[11]，说明0.75 % 浓度的茶树精油能有效抑制MRSA生长，茶树精油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.75 %。

2.4.3 茶树精油作用下MRSA的动态生长曲线 将茶树精油加入含MRSA（106CFU/ ml）的MHB培养基中，使茶树精油浓度为1×MIC、2×MIC、4×MIC，并设置生长对照组，设置取样时间点为0、1、2、4、8、16、24 h。应用活菌计数法测定各组菌量数，36 ℃ 恒温培养18 h，做菌落计数，重复三次试验，绘制MRSA动态生长曲线图，结果见图2。结果显示茶树精油对MRSA的动态生长，2×MIC的茶树精油能够显著抑制MRSA生长，4×MIC浓度的茶树精油作用下MRSA几乎无生长。

图2 MRSA动态生长曲线

3 讨论

（1）采用水蒸汽蒸馏法提取茶树精油得茶树精油1.6 g，得率1.6 %，该方法简便易行[12]，提取快速，提取成本较低，无需繁琐的操作步骤，适合工厂快速大量的生产提取，所得茶树精油杂质较少，颜色为无色至淡黄色[13]，主要成分含量为松油烯-4-醇为35.4 %、1,8-桉叶素为1.2 %；提取效果较好，其中松油烯-4-醇与1,8-桉叶素含量符合GB/T 26514-2011标准规定。（2）使用该方法可以快速的鉴别茶树精油中的主要成分松油烯-4-醇与1,8-桉叶素，与标准品色谱相对应的位置显示相同颜色的斑点[14]，该方法可以便捷快速的鉴别茶树精油的主要成分[15]，不仅操作简便易行，且图谱显色迅速准确，可作为茶树精油主要成分鉴别的有效方法。（3）通过本研究可以得出茶树精油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用的MIC为0.75 %，观察茶树精油作用下MRSA的动态生长曲线，结果显示在2×MIC浓度的茶树精油作用下MRSA的生长和繁殖受到了明显抑制，茶树精油4×MIC浓度下MRSA无生长。

综上所述，使用水蒸汽蒸馏法提取茶树中的茶树精油操作简便高效，提取得到的茶树精油主要成分松油烯-4-醇与1,8-桉叶素含量分别为35.4 %与1.2 %，对茶树精油的主要成分松油烯-4-醇与1,8-桉叶素鉴别方法反应快速、准确，通过茶树精油对MRSA作用的抑菌试验研究，2×MIC浓度的茶树精油即可显著抑制MRSA生长繁殖，4×MIC浓度的茶树精油作用于MRSA，几乎无生长，抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）效果显著，本研究为茶树精油抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）提供理论依据，为天然药物替代抗生素奠定基础。