ERRα参与冷应激仔猪肠道巨噬细胞表型重塑的探讨

连帅，王建发，杨焕民

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

冷刺激是制约北方寒区养猪业发展的主要环境应激源之一。幼龄仔猪的体温调节能力较差，对环境温度变化极为敏感，特别是冷应激[1-2]，这不仅会阻碍初乳免疫球蛋白的吸收，而且还会加快免疫球蛋白的分解代谢，影响巨噬细胞的吞噬能力，导致仔畜疾病易感性增加[3-4]；以致每年冬春季节病毒性等腹泻疾病高发[5]，损害仔猪胃肠消化系统，降低胃肠黏膜完整性，引起一系列营养缺失性损伤，是幼龄仔猪死亡率高的主要因素之一。仔猪肠道固有免疫系统在抵御病原侵入过程中起到重要作用，巨噬细胞（Macrophages，Mø）作为固有免疫的重要组成部分，通常扮演抵御病原体入侵的“排头兵”和激活适应性免疫的“通信兵”，同时在组织损伤修复中发挥重要作用[6-7]。肠巨噬细胞约占健康肠固有层细胞总数的20%，但迄今为止，对仔猪肠道区域驻留巨噬细胞在免疫防御中的关注较少，以及其在冷应激诱发肠道疾病中的响应机制还不清楚。

巨噬细胞通过表型重塑（M1和M2型等）的方式维持免疫稳态[8]，而这一稳态平衡是高度能量依赖的过程，在低温环境下，机体通过摄取营养物质来维持体温和防御感染，在这一过程中免疫细胞不断地改变和调整自身状态，发挥其免疫效应，同时，机体的代谢也转向更适合免疫细胞所需的状态，为其提供必要的能量支持。雌激素相关受体α（ERRα）作为能量代谢和线粒体功能的关键调节因子，缺失可导致机体能量稳态失衡，丧失维持正常体温的能力[9]，并诱导巨噬细胞的过度炎症反应[10-11]，降低巨噬细胞抗感染能力[12]。课题组前期研究显示，冷应激影响LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞表型改变，并且ERRα参与到冷应激诱导的代谢重编程。据此，我们推测冷应激发生时，ERRα在维持仔猪肠道巨噬细胞“免疫代谢（Immunometabolism）”稳态平衡中发挥重要作用。这为揭示冷应激与仔猪肠道疾病发生的内在联系，为寻找有效措施防御仔猪冷应激提供更为前沿的参考，对保障畜牧业的持续健康发展具有重要意义。

1 冷应激影响巨噬细胞功能

在应激反应中，神经内分泌系统调动机体做好“战斗或逃跑”准备来应对应激，同时应激的类型、强度和持续时间影响免疫系统功能。对于感染性、肿瘤性和炎症损伤等大部分免疫应答都需要巨噬细胞参与，它可以有效清除创伤引起或组织重塑过程中的细胞凋亡碎片，还通过吞噬作用和活性氧的产生来识别和破坏体内的外来物质，最后通过抗原呈递和分泌细胞因子来驱动T细胞反应[13]。

不同应激源对巨噬细胞功能的影响不同，生理和心理应激源（足底电击刺激）可导致巨噬细胞吞噬能力减弱[14]，而另一项研究则显示，束缚应激可导致巨噬细胞吞噬能力增强[15]。而不同活化状态的巨噬细胞对冷应激的响应也不一样，急性冷应激（4℃/4 h）小鼠体内的静息巨噬细胞在Fcγ和甘露糖受体的介导下表现出较低的吞噬能力，而活化的巨噬细胞通过相同的受体则具有更强的吞噬能力，但后者对炎症部位凋亡细胞的吞噬能力和产生转化生长因子β（TGF-β）的能力较弱[16]。慢性冷应激条件下（4℃/4 h每天，连续刺激7 d），BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞表型发生了改变，主要表现为静息巨噬细胞不依赖于受体的吞噬功能受到了广泛抑制、促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）减少、抗炎细胞因子（如IL-10等）生成增多，进而抑制机体的适应性免疫功能，使动物感染病原和促进肿瘤细胞增殖的风险更大[17]。

冷应激可诱导炎症反应和促进病毒复制。有研究表明，猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的冷诱导RNA结合蛋白（CIRBP）可以促进猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）诱导的炎症反应，PRRSV在不同程度上诱导巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子和蛋白的表达，而CIRBP可由低温诱导产生[18]，所以冷应激可能通过诱导PAMs中的CIRBP的表达，促进PRRSV的复制；另一项研究结果显示，过表达热休克蛋白70（HSP70）可以促进猪流行性腹泻病毒（PEDV）mRNA和蛋白在细胞中的转录和表达，同时作者通过体内外实验也证实了冷应激可诱导HSP70在仔猪肠道组织和肠上皮细胞内的表达水平升高[19]，这也从HSP70角度揭示了猪流行性腹泻在冬季高发的可能原因。除感染肠道上皮细胞以外，PEDV还被证实可以感染肺泡巨噬细胞，但在低温应激时巨噬细胞如何响应病毒的侵入还有待进一步研究。

2 巨噬细胞维持肠道稳态

巨噬细胞，作为固有免疫的重要组成部分，存在于大多数组织中，并且形成组织特异性表型参与免疫反应，以维持组织稳态，保护机体免受病原入侵[20]。肠巨噬细胞网络驻留在肠道肌层，这种网络从胃一直延伸到结肠末端，主要在浆膜与纵肌之间、纵肌与圆形肌之间、外圆肌与内圆肌之间分层堆积[21]。

巨噬细胞作为肠道免疫系统对抗外界抗原的“排头兵”，通过其表面模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）识别损伤相关的分子模式（Damage associated molecular patterns，DAMPs） 和病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。由于肠道免疫环境的复杂性，一方面，肠道巨噬细胞需要与肠道内大量无害的抗原保持耐受；另一方面，它们又随时准备应对可能危及生命的病原体。如果不能在这种耐受性和反应性之间实现稳态平衡，就会导致肠道疾病的发生[22]。当然，巨噬细胞维持肠道稳态与其自身活化表型有关，通过表达一系列的功能表型来响应不同的环境信号。目前，活化的巨噬细胞主要分为经典活化M1型和替代活化M2型[23]。当病原侵入，干扰素 γ（IFN-γ）和Toll样受体配体等刺激巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞，其特征是大量分泌TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12等促炎因子和表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）、活性氮中间体（RNI）、活性氧（ROS）促进TH1反应，并高表达主要组织相容性复合体（MHC-II）、趋化因子受体CCR2，参与抗原递呈；与之相反，IL-4和IL-13能诱导巨噬细胞向M2型极化，分泌IL-10等抑炎因子，有助于寄生虫清除、抑制炎症反应、促进肿瘤发生发展、免疫调节、并可维持组织稳态[24]。

巨噬细胞维持组织稳态又体现在它强大的组织损伤修复能力，已有研究表明，腹膜巨噬细胞能迅速浸润受损组织，并呈交替活化表型，分解坏死细胞[7]，通过分泌转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF1），并高表达趋化因子受体CX3CR1、甘露糖受体（CD206）、清道夫受体（CD36）等与上皮细胞或组织进行“对话”，促进组织损伤修复[6]。但是，仔猪肠道驻留巨噬细胞是否也具备这种组织修复能力，以及冷应激仔猪肠道巨噬细胞呈现怎样的活化表型，目前还不明确。

图1 巨噬细胞在促炎、组织修复、抗炎过程中的活化表型[6]Fig.1 The activated phenotype of macrophages in the process of proinflammatory，tissue repair and anti-inflammatory

3 巨噬细胞表型重塑依赖能量代谢途径

近年来，细胞代谢活动重编程被证明在免疫系统的激活和过度炎症反应中起着关键作用[25]。能量代谢途径在巨噬细胞表型重塑过程中发挥重要作用，糖酵解支持巨噬细胞向M1型极化，而M2型极化则依赖脂肪酸氧化代谢途径[26]；包括雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）在内的氨基酸代谢信号通路在M2型巨噬细胞表型重塑过程中发挥重要作用[8]；同时，巨噬细胞在维持机体铁稳态中同样也发挥重要作用。

3.1 糖酵解和脂肪酸氧化途径

糖酵解可以促进细胞炎性因子的产生，维持M1型巨噬细胞的功能效应，被脂多糖（LPS）或IFN-γ激活的M1型巨噬细胞内糖酵解活跃（瓦博格效应）、氧化磷酸化（OXPHOS）减少[27]。相反，抗炎M2型巨噬细胞被IL-4激活后，是以OXPHOS和脂肪酸氧化增强为主要特征，只要氧化磷酸化在细胞内仍然活跃，M2型巨噬细胞的极化则不需要糖酵解过程，而抑制脂肪酸氧化后M2巨噬细胞抗炎能力减弱[28]。同时，M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞又都影响胰岛素敏感性，进而影响糖代谢[29]。此外，巨噬细胞是脂肪组织血管基质部分（SVF）最丰富的细胞类型，在瘦肉脂肪和肥胖脂肪中分别占10%和40%，肥胖脂肪组织中主要以促炎M1巨噬细胞为主，而瘦肉脂肪组织中的巨噬细胞以M2为优势表型，慢性冷刺激可诱导脂联素在皮下脂肪累积，进一步促进皮下脂肪组织巨噬细胞向M2表型极化，介导脂肪褐变[30]。

此外，O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）糖基转移酶（OGT）介导的葡糖糖代谢参与先天性免疫，OGT通过诱导巨噬细胞STAT3的O-GlcNAc糖基化修饰（O-GlcNAcylation）来拮抗STAT3的磷酸化，进而弱化STAT3/IL-10信号转导通路，加剧肠道炎症反应[31]。由此猜测，OGT介导的O-GlcNAcylation促进巨噬细胞向M1型极化，但具体机制还有待进一步探讨。课题组研究发现，急性冷应激诱导小鼠肝脏组织蛋白的O-GlcNAcylation，并伴随着葡萄糖代谢水平的升高[32]，而免疫细胞中高水平的葡萄糖代谢是炎症性疾病的一个显著特征（如脓毒症）[33]，那么冷应激是否通过改变葡萄糖等代谢途径影响仔猪肠道巨噬细胞表型重塑值得我们进一步研究。

3.2 氨基酸代谢途径

氨基酸代谢通过影响巨噬细胞的表型重塑来影响免疫系统功能，在极化的巨噬细胞中，L-精氨酸（L-Arg）的代谢受一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）和精氨酸酶（ARG1）的调节，NOS2将L-Arg代谢为一氧化氮（NO）和L-瓜氨酸，ARG1将L-Arg代谢成鸟氨酸和尿素。NOS2在M1型巨噬细胞中表达并催化产生NO，而NO是其杀菌活性的重要效应因子；反之，IL-4激活的M2型巨噬细胞表达高水平的ARG1，限制了L-Arg代谢生成NO，并进一步催化合成多胺，这有利于细胞增殖、促进胶原蛋白的合成和组织重塑[34]。此外，巨噬细胞通过溶酶体分解吞噬的细胞，所以溶酶体可以不断产生大量的营养物质，如氨基酸和胆固醇。当细胞内氨基酸含量足够高时，营养传感器mTORC1从胞浆募集到溶酶体膜，在IL-4和Lamtor1作用下被激活，致使巨噬细胞被极化为M2型巨噬细胞，当Lamtor1缺乏、氨基酸饥饿或v-ATPase和mTOR抑制时，会导致M2极化减弱和M1极化增强，所以巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬可以抑制巨噬细胞的炎症反应[8]。

此外，巨噬细胞在维持机体铁稳态中发挥重要作用，巨噬细胞通过吞噬衰老的红细胞吸收铁，又将铁循环再用于红细胞生成等过程。有研究证实巨噬细胞的极化与铁的代谢调节有关，IL-4活化的M2型巨噬细胞高表达CD163与CD94（血红素摄取）、低表达储铁蛋白（铁存储）和高表达铁转运蛋白（铁转出），所以，M2型巨噬细胞处于铁转出状态，以促进基质重塑、免疫调节和细胞增殖；相反，IFN-γ活化的M1型巨噬细胞表现为低表达CD163、高表达储铁蛋白和低表达铁转运蛋白的表型，此时M1型巨噬细胞处于铁保留状态，起到抑菌和抑制肿瘤的作用。但铁代谢异常可能导致细胞内铁潴留，使巨噬细胞向M1型无限制极化，影响受损组织的愈合和修复[34]。因此，对铁的处理已成为巨噬细胞极化的关键特性，在免疫病理学中具有广泛的意义。

上述研究从免疫信号通路代谢调节的角度，揭示了能量代谢与巨噬细胞表型之间存在着必然联系。

4 ERRα在能量代谢调控中的作用

ERRα作为能量代谢和线粒体功能的关键调节因子，是被最早发现（1988）的孤核受体之一，已被证明参与到糖脂代谢、线粒体生物发生以及各种细胞组织器官的代谢适应，主要在高耗能的组织细胞中表达，可通过促进瓦博格效应和调节关键癌基因的表达来影响癌细胞的增殖。值得注意的是，ERRα对处在高能量需求环境（如：冷应激）中的机体适应代谢反应至关重要，缺乏ERRα的小鼠对病原感染和寒冷应激的抵抗力较差，缺乏维持核心体温的能力，并且降低棕色脂肪组织（BAT）中热量生成和线粒体能量代谢相关基因的表达[9，12]，这些研究提示，ERRα是适应性产热的关键。这种适应性产热主要表现在ERRα在线粒体生物发生中的调控。到目前为止尚未发现ERRα的内源性配体，但是它能在核受体PPARγ 协同激活因子 α（PGC-1α）或PGC-1β 共刺激因子的辅助下形成活化二聚体，结合雌激素受体反应元件（Estrogen response element，ERE）和雌激素相关受体反应元件（ERRE）发挥其调控作用。而核受体PPARγ在IL-4的重复刺激下，能促进巨噬细胞表型的显著改变[35]。由此可见，ERRα可能通过ERRα/PGC1-α/β信号转导通路参与巨噬细胞的表型重塑。此外，被PGC-1α或PGC-1β活化的ERRα参与调控线粒体呼吸和活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的生成，而ROS生成是巨噬细胞发挥先天性免疫应答的关键途径之一。

5 ERRα参与先天性免疫应答

ERRα在先天性免疫应答反应中的关键调控作用越来越被科研工作者们所重视[10，12]，被证明可通过促炎细胞因子介导骨源性巨噬细胞活化，这也与其调控能量代谢和线粒体生物发生有关。在对病原或危险刺激的反应中，免疫细胞进行代谢重编程，调动还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶体和线粒体向吞噬泡内释放大量ROS以实现对病原体的杀灭和清除[36]。有研究表明，ERRα在IFN-γ诱导的巨噬细胞氧化代谢中发挥重要作用，主要是通过调控巨噬细胞线粒体呼吸链的表达和线粒体ROS的生成，参与IFN-γ诱导的对李斯特菌感染的抗菌反应，缺乏ERRα的小鼠易受李斯特菌的感染[37]。然而，巨噬细胞是如何维持ROS的动态平衡，并在清除病原体的同时还能防止ROS的氧化损伤，实现自我保护，目前尚不完全清楚。这可能与ERRα的抑制性负反馈调节机制有关，在生理刺激下诱导表达的PGC-1α增强ERRα的转录活性，上调ERRα的表达，又进一步促进共抑制因子受体相互作用蛋白140（RIP140）的表达[38]，形成抑制性负反馈调节环路，调整自身代谢姿态，维持巨噬细胞先天性免疫稳态。

此外，调控细胞自噬是ERRα参与先天性免疫反应的另一个重要途径，有研究表明，ERRα是巨噬细胞自噬的关键激活因子，能增强自噬相关基因（Atg）的转录激活，促进宿主的先天性免疫防御[12]。除了调控自噬以外，ERRα还被证实是一种TLR诱导炎症反应的新型调节因子，在IFN-γ或LPS活化的巨噬细胞中高表达，通过转录激活锌指蛋白A20控制细胞代谢重编程，负性调控巨噬细胞TLR4信号通路，抑制炎症反应，而ERRα基因缺失小鼠受到免疫刺激后表现为过度的炎症反应[10]。这些发现，对基于靶向ERRα的细胞内病原感染的治疗和炎症反应的改善提供了新的途径。

6 展望

代谢与免疫是机体生存的最基本需求，通过它们之间复杂而密切的相互作用来共同维持机体的稳态平衡，“免疫代谢”作为新的领域，其重要作用近年来越来越受到人们的关注。巨噬细胞作为固有免疫的重要组成部分，代谢重编程在调控其表型和可塑性方面发挥着重要作用。课题组前期研究结果证实了动物对冷刺激的响应是一个高耗能过程，并诱导炎症反应；同时也发现冷应激影响LPS诱导的巨噬细胞表型改变，并且ERRα参与到冷应激诱导的代谢重编程。基于上述，我们推测：ERRα作为“免疫代谢”的重要调控媒介，在冷应激发生过程中可能介导了仔猪肠道巨噬细胞表型重塑并维持其稳态平衡。这为全面认识冷应激与仔猪肠道疾病发生的内在联系，寻找有效措施防御仔猪冷应激提供研究依据。