犬奇异变形杆菌及其噬菌体分离鉴定

宋军，周志新，王晗晟，刘梦，郑家三，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319）

奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）是一种无荚膜、无芽孢、有鞭毛和菌毛的革兰氏阴性杆状细菌，是变形杆菌属中最重要的病原菌之一[1]。以产生脲酶和固体培养基上形成典型的迁徙运动能力而闻名[2]。奇异变形杆菌是一种腐生性的条件致病菌，分布较广，可存在于多种环境中，常见于土壤、污水、动物体表、肠道等部位，能够引起人和动物伤口、眼睛、呼吸道、胃肠道和尿道等感染[3]。奇异变形杆菌是继大肠杆菌之后最易引发人泌尿道感染的细菌，可引起严重的泌尿道组织学损伤并与膀胱和肾脏结石的形成有关[4-5]。

近年来，奇异变形杆菌作为人兽共患的病原菌，除了能够感染人以外，还能感染鸡、猪、山羊、水貂、狐狸、恒河猴等多种动物，造成严重的经济损失[6-8]。同时，奇异变形杆菌被证明能够抵抗多种抗生素和获得能够生产β-内酰胺酶拓展谱的能力[9-11]，导致严重的公共卫生问题[12]。

噬菌体广泛存在于自然界，是一类可以感染并裂解细菌的病毒。噬菌体具有极强的宿主特异性，除对宿主菌具有裂解作用，不会感染其他正常菌群，对人和动物无害[13]。近年来，噬菌体在防治人和动物疾病、农业生产、食源性感染防治应用广泛[14-17]。特别是作为一种抗生素替代物或补充治疗方法[18]，在控制病原菌的传播以及治疗耐药性细菌感染等方面取得了巨大的进展。在当下耐药菌株不断出现、新型抗菌药物研发进展缓慢的状况下，噬菌体可作为治疗感染性疾病的手段再次引起人们的关注。

前期研究[19]从城市居民区生活污水中分离出4株奇异变形杆菌的噬菌体，并对其生物学特性进行研究，表明其具有较好的特异性和裂解活性。周祥莹等[20]以貉源奇异变形杆菌为宿主菌分离出噬菌体，验证其体外裂解活性，为貉奇异变形杆菌病的防治提供了基础。研究从感染性结石犬的尿液中分离到致病菌，通过形态特征、培养特征、16S rRNA测序等，判定为奇异变形杆菌，并具有较强的耐药性。再以分离菌株为宿主菌，从污水中分离裂解性噬菌体，命名为vB_PmM_XNR，对其生物学特性进行研究，同时评价裂解性噬菌体对奇异变形杆菌的体外裂解活性，以期为治疗和控制奇异变形杆菌感染和研制新型抗菌制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

LB培养基、营养肉汤、Baird-Parker琼脂培养基、亚碲酸钠卵黄增菌液、尿素酶琼脂基础培养基购自海博（青岛）生物技术有限公司；细菌基因组提取、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒、透析袋购自索莱宝（北京）科技有限公司；DNA Ladder Marker、PCR Mix，购自近岸蛋白质科技有限公司；其他常规试剂均为分析纯。聚乙二醇8000购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；低温冷离心机（德国艾本德股份公司）；JEM-2100 Plus透射电子显微镜（日本电子株式会社）；Bio-Rad S1000TMPCR仪（美国BIO-RAD S1000）。

1.2 细菌分离及生物学特性分析

1.2.1 细菌分离

病料采自于大庆市农大动物医院。无菌采取犬膀胱尿液，2 000 r·min-1离心5 min，弃去尿液上清液，将沉淀物接种于Baird-Parker琼脂培养基和血琼脂固体培养基上，置37℃培养24 h后，挑取典型菌落进行分离纯化，染色镜检。

为了进一步观察分离菌株的形态特征，取纯化的菌液10μL（105CFU·mL-1）置于铜网，静置15 min左右，用滤纸吸干多余液体，用负染液（2%磷钨酸溶液）染色5 min，滤纸吸干染液后，用蒸馏水清洗2遍，干燥后置于透射电镜（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）观察。

1.2.2 溶血能力检测

将分离纯化的细菌划线接种到新鲜配置的血琼脂培养基（脱纤维羊血5%），置于37℃恒温培养24～48 h，观察细菌。

1.2.3 细菌脲酶鉴定

参照W.B.Christensen等[21]的试验方法，将分离纯化的细菌接种于尿素培养基上，37℃恒温培养10～12 h后，观察尿素培养基颜色变化。尿素培养基由橘黄色变红色则表明细菌能够产生尿素酶。

1.2.4 16 Sr R NA的扩增

参考细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，稀释至浓度为20 ng·μL-1备用。设计细菌16S通用引物，引物序列为F5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′和R5′-GTTACCTTGTTACGACT-3′，预扩增片段大小约为1 500 bp。PCR扩增体系（总体积为50μL）：Rnase-free 2×Taq Mix 25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，H2O 19μL。扩增程序：94℃预变性90 s；94℃变性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃再延伸5 min。使用DNA纯化回收试剂盒切胶纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳观察条带大小无误后送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果与GenBank中其他序列进行比对分析。

1.2.5药敏试验

挑取单个菌落置于LB培养基，37℃培养6～8 h，取100μL菌液滴入LB固体培养基中涂布均匀，将不同的药敏纸片置于均匀涂满菌液的LB固体培养基中，37℃培养24 h，测量抑菌环直径，参照CLSI（2014）标准[22]判定结果。

1.3 噬菌体分离鉴定及生物学特性分析

1.3.1 噬菌体的分离纯化及电镜观察

取未处理污水经纱布初滤大颗粒杂质后加入CaCl2终浓度为1 mmol·L-1，6 000 g离心15 min除去其他杂质。采用透析袋浓缩离心后的污水上清4℃过夜，浓缩后的污水经0.22μM滤膜过滤除菌、备用。以分离到的菌液为宿主菌分离噬菌体，将100 mL除菌的滤液上清加入100 mL 2×LB培养基，滴入对数生长期的宿主菌100μL，37℃160 r·min-1振荡培养12 h，10 000 g离心10 min，将上清经0.22μM滤器过滤除菌。将滤液和宿主菌充分混合，接种到融化的半固体培养基（琼脂含量0.75%）充分混匀，倒入营养琼脂平板中，凝固后置于37℃恒温培养8 h，观察噬菌斑的形成情况。挑取透明、形状规则的噬菌斑，采用双层平板法分离纯化8～10次，可以得到纯化的噬菌体。

为了进一步观察vB_PmM_XNR的形态，采用透射电镜（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）观察。简要步骤：取噬菌体悬液10μL（106PFU·mL-1）置于铜网，静置20 min左右，用滤纸吸干多余液体，用负染液（2%磷钨酸溶液）染色5 min，滤纸吸干染液后，用蒸馏水清洗2遍，干燥后置于透射电镜（JEM-2100 Plus，JEOL，日本）观察。

1.3.2 最佳感染复数测定及一步生长曲线

将细菌培养至对数生长期（约1×108CFU·mL-1），噬菌体与细菌各100μL，按照比例为100、10、1、0.1、0.01、0.001进行混合，室温静置10 min。37℃恒温160 r·min-1振荡培养4 h。双层平板法测定噬菌斑个数，以噬菌体滴度增加最高比例的为最佳感染复数，重复3次取均值。

将对数生长期的分离株（OD600=0.3，约为1×108CFU·mL-1）和噬菌体按MOI等体积（各500μL）混合后，置37℃静置孵育15 min，8 000 g离心5 min，弃上清。沉淀重悬于10 mL LB中，37℃摇床160 r·min-1振荡培养。每间隔5 min取样，测定不同时间点噬菌体滴度，绘制一步生长曲线。

1.3.3 噬菌体温度和pH稳定性实验

将等体积噬菌体（108PFU·mL-1）分别置于不同温度（4、25、37、42、60和70℃）条件下孵育1 h后，采用双层平板法检测噬菌体滴度变化，评价噬菌体热稳定性。同样，将等体积的噬菌体分别加到不同pH（pH=2.0～12.0）的缓冲溶液中37℃水浴中孵育1 h，检测噬菌体滴度。

1.3.4 氯仿敏感性检测

取1 mL（108PFU·mL-1）噬菌体液加入氯仿（1%体积），充分混合15 s后置于室温静置30 min，待分层后取上层溶液测定滴度[23]。

1.4 体外裂解作用

将奇异变形杆菌PM-XNR培养至对数生长期，PBS（pH=7.4）洗涤去除培养基，并调整细菌浓度为108PFU·mL-1，加入1 mL效价约为108PFU·mL-1的噬菌体XNR于37℃静置培养，分别于0、4、8、12、24 h测定培养液中细菌浓度以及噬菌体效价。

2 结果与分析

2.1 革兰氏染色和生物学特性检测

分离株在Baird-Parker琼脂培养基上菌落呈圆形褐色，边缘围绕一圈透明带，符合奇异变形杆菌在Baird-Parker琼脂培养基上生长特性，如图1 A所示。分离株经革兰氏染色后，显微镜下观察呈红色，无芽孢及荚膜，具有多形态性呈杆状、球状等（见图1 B）；透射电镜能够清楚看到细菌形态，表面粗糙、有鞭毛（见图1 C）；分离株在血琼脂培养呈灰白色菌落，具有溶血现象，散发特殊的腐败性臭味（见图1 D）；分离株在尿素培养基中，培养18 h变为粉红色，说明分离株产生脲酶分解尿素（见图1 E），这也是泌尿系统产生结石的主要原因之一。通过上述革兰氏染色和生物学特性实验可以初步判定分离株为奇异变形杆菌。

图1 分离菌生物学特性及电镜观察结果Fig.1 Biological characteristics and observation by transmission electron microscope

2.2 16Sr RNA序列同源性比较

细菌基因组经PCR扩增后，在1 500 bp左右出现单一条带（图2）。测序后BLAST分析比对，发现与其Query程度最高的几种16SrRNA序列均为奇异变形杆菌，其Query程度均高达98%以上，因此可以确定分离到的菌株为奇异变形杆菌，命名为PMXNR。

图2 16Sr RNA扩增结果Fig.2 Amplification results of 16SrRNA

2.3 药敏试验

18种药品对PM-XNR进行药敏试验，其中该菌株PM-XNR对头孢抗生素头孢吡肟敏感，对阿米卡星、氨苄西林、左氧氟沙星、氯霉素和环丙沙星中度敏感；对其他使用的抗生素均耐药。说明犬源奇异变形杆菌具有较强的耐药性。

表1 PM-XNR药敏试验结果（抑菌圈直径/mm）Table 1 Drug sensitivity test results of PM-XNR

2.4 噬菌斑及噬菌体电镜观察

以分离获得的奇异变形杆菌PM-XNR为宿主菌，通过双层琼脂平板法从污水中分离出1株裂解性噬菌体，命名为vB_PmM_XNR（缩写为XNR）。在双层琼脂平板上可见形状规则、边界清晰、透明的噬菌斑（图1 A）。XNR经负染后电镜显示（图1 B），XNR头部呈二十面体对称，直径约为60±3 nm，具有短尾。

2.5 噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线

如表2所示，当MOI=0.01时，噬菌体XNR感染宿主后噬菌体滴度增加了将近104；为XNR的最佳感染复数。

图3 vB_PmM_XNR噬菌斑和电镜图片Fig.3 Phage plaque and electron micrograph of vB_PmM_XNR

表2 vB_PmM_XNR最佳感染复数Table 2 Optimal multiplicity of infection of vB_PmM_XNR

当MOI=0.01时噬菌体产出量最高，按0.01的比例绘制一步生长曲线。XNR一步生长曲线如图4所示。XNR感染宿主菌后15 min内（潜伏期）滴度无明显的变化，感染后15～55 min内，噬菌体数量急剧增加，可知XNR爆发时间约为40 min，平均裂解量约为80 PFU·cell-（1裂解量=爆发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度）。

图4 vB_PmM_XNR一步生长曲线测定Fig.4 One-step growth curve of vB_PmM_XNR

2.6 噬菌体热稳定性、pH稳定性及氯仿敏感性

噬菌体分离自污水中，对环境的适应能力和耐受能力相对较强[24]。温度敏感性实验结果（图5 A）表明，噬菌体vB_PmM_XNR在4℃～42℃之间，活性基本稳定。当温度升高到60℃时，噬菌体vB_PmM_XNR滴度下降100倍左右；达到70℃时，噬菌体全部失活。

从结果（图5 B）可以看出噬菌体vB_PmM_XNR经不同的pH处理1 h后，pH值为2.0和12.0时噬菌体失活；而pH值在6.0～8.0范围内时酸碱度对噬菌体的活性影响不大。上述表明，vB_PmM_XNR具有较好的热稳定性和耐酸碱性，能够满足后续动物体内治疗的需要。

图5 噬菌体vB_PmM_XNR的热稳定性和酸碱稳定性测定Fig.5 Determination of thermal and pH stability of vB_PmM_XNR

由表3可知，氯仿对噬菌体效价无显著影响，说明噬菌体vB_PmM_XNR粒子表面不含有脂类物质，对氯仿不敏感。

表3 噬菌体vB_PmM_XNR氯仿敏感性Table 3 Sensitivity to chloroform of vB_PmM_XNR

2.7 噬菌体对奇异变形杆菌的裂解作用

从图6中可以看出，XNR对PM-XNR具有较好的裂解作用。XNR作用24 h后，细菌浓度下降3个数量级，由108CFU·mL-1降至105CFU·mL-（1清除效率约为99.9%）；而XNR效价从108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1。PM-XNR浓度随XNR作用时间延长不断降低，XNR效价不断增加，表明噬菌体XNR能够持续有效抑制和清除细菌。

图6 噬菌体XNR对奇异变形杆菌的裂解作用Fig.6 The lysis effect of phage XNR on Proteus mirabilis

3 讨论与结论

近年来，奇异变形杆菌作为人兽共患的病原体，在人与动物中引起的感染频繁发生[8]。特别是能够感染宠物的病原菌，奇异变形杆菌就是其中之一。宠物与人类接触密切，增加了人类感染性疾病患病几率，对人类健康造成一定的威胁，同时也受到了广泛的关注[25]。此外，广谱抗生素的大量使用及滥用，导致临床耐药菌株的产生并且耐药性不断增加，这也为临床治疗带来了较大的挑战，成为严重的医学问题[12，26]。从大庆市农大动物医院患犬尿液中分离到奇异变形杆菌，该菌株具有溶血活性和产脲酶分解尿素，说明该菌株具有致病性，与宠物出现的感染性结石症状相吻合。

前期研究表明，多数奇异变形杆菌对氨基糖苷类与β-内酰胺类药物敏感[27-29]。林燕青等[30]对2016～2018年奇异变形杆菌耐药性进行研究，发现奇异变形杆菌对氨苄西林、头孢唑林、复方新诺明、呋喃妥因的耐药率均＞50%，并且氨苄西林/舒巴坦的耐药率从29.8%上升到42.6%；对庆大霉素的耐药率从35.1%降到27.9%。奇异变形杆菌对头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、阿米卡星的耐药率均＜6%。杨睿等[31]作用从腹泻仔猪中分离的15株奇异变形杆菌均有多重耐药性，其中13株含有3种以上的耐药基因。结果表明，腹泻仔猪中分离的奇异变形杆菌含有大量的耐药基因和多重耐药性，可以引起仔猪腹泻症状，导致抗生素在临床治疗时不能发挥。试验对分离的PM-XNR进行药敏试验，发现PM-XNR对大多数药物耐药或不敏感，仅对四代头孢吡肟敏感，超出正常宠物的临床用药，说明分离自犬的奇异变形杆菌耐药性极强，这可能与人类或宠物抗菌药物的使用不当和滥用存在一定联系。同时，有研究表明将动物源和人源奇异变形杆菌菌株进行了毒力基因、表型方面进行比较，未发现不同来源菌株的毒力特征有明显的差异[32]。说明犬源奇异变形杆菌对人类健康存在一定威胁。

噬菌体自发现之初便应用于细菌性疾病的治疗，并取得了良好的治疗效果[33]。由于广谱抗生素的广泛应用，使噬菌体的研究逐渐被人们遗忘。1958年余贺利用噬菌体成功治愈了烧伤病人的绿脓杆菌感染，开创了国内噬菌体治疗的先河。随着抗生素的大量及不正确的使用，导致细菌的耐药性越来越严重，每年因细菌耐药性死亡的人数也在逐渐攀升，据统计到2050年全球每年因细菌耐药性死亡的人数达100万人。噬菌体是一类能够特异性地裂解宿主细菌，不污染环境、无残留、不易产生耐药性的病毒，有望成为抗生素的替代药物。但是，目前临床上针对奇异变形杆菌并没有多少裂解性能较好的噬菌体。

研究针对犬源奇异变形杆菌从污水中成功分离到裂解性噬菌体vB_PmM_XNR，电子显微镜观察vB_PmM_XNR具有二十面体头部结构和可收缩尾部，可判断为肌尾噬菌体科。噬菌体感染复数（MOI）能够表示出感染时噬菌体与细菌的数量比值，也是平均每个细胞感染噬菌体的数量，可应用于制备高浓度噬菌体裂解液[34]。研究中，噬菌体XNR的MOI为0.01。按照噬菌体MOI绘制一步生长曲线，可以计算出潜伏期为15 min，爆发期持续40 min，爆发量为80 PFU·cell-1。这与大多数报道的噬菌体的潜伏期和爆发期结果基本相一致，但是爆发量各报道间差异较大[35-36]。

吸附过程是噬菌体能够裂解细菌的重要步骤，多数研究表明，吸附过程极易遭受环境（pH、温度、离子等）因素的影响，在应用过程中，噬菌体还要保证在体内（血液、消化液）等极端环境下生存[37-38]，因此，要求噬菌体对酸碱度、温度等有一定的耐受性。vB_PmM_XNR在4℃至42℃之间滴度稳定，满足噬菌体吸附的最佳温度范围；pH 6.0～8.0范围内活性最好，具有体内应用治疗的潜力。该噬菌体经分离纯化后，效价稳定、较高，在适宜的条件下24 h可使奇异变形杆菌下降3个数量级，说明XNR具有较好的裂解效率，具有潜在应用价值。噬菌体通过宿主菌及自限性繁殖，是噬菌体具有的基本特征。在裂解奇异变形杆菌的同时，XNR效价从108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1，说明噬菌体在裂解细胞后能够维持效价稳定，并且有所增加，能够发挥持续的裂解作用。

试验从临床尿石症病犬尿液中分离获得奇异变形杆菌。菌株具有溶血活性，能产生脲酶，具有耐药性，满足感染性结石症的特征。以奇异变形杆菌分离株为宿主菌，分离出一株裂解性噬菌体，命名为vB_PmM_XNR。该噬菌体通过对其生物学特性、体外抗菌试验表明具有治疗和控制奇异变形杆菌引起泌尿系统感染的潜力。