苹果酸酶2乙酰化调控脑胶质瘤细胞增殖的机制

张 成，牛朝诗，梅加明，司文霞，魏祥品

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的半数以上，恶性程度高，易复发，对放化疗不敏感，治疗困难。近几年来，人们对肿瘤细胞代谢的认识逐渐加深，靶向肿瘤细胞代谢成为一种有前景的治疗策略。

苹果酸酶2(malic enzyme 2，ME2)是苹果酸酶家族的一员，定位于线粒体中。作为调控线粒体氧化还原稳态的代谢酶，ME2在包括脑胶质瘤在内的许多肿瘤中高表达，然而其作用机制并不清楚。研究指出乙酰化修饰在调控肿瘤细胞代谢中发挥关键作用，该研究旨在阐明ME2乙酰化修饰的分子机制及其在恶性脑胶质瘤增殖中的功能，为进一步的体内研究提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

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质粒 pCDNA3.1-HA质粒、pCDNA3.1-Flag质粒、shRNA空载体质粒pLKO.1和慢病毒包装系统质粒pMD2.G、pSPAX由本实验室保存。

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细胞 人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87MG和人肾上皮细胞系293T购自中国科学院上海细胞库。

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主要试剂 胎牛血清(FBS)及DMEM培养基购自美国Hyclone公司；鼠抗人Flag、HA、actin抗体购自武汉ABclonal公司；去乙酰化酶Sirtuin3(deacetylate Sirtuins 3，SIRT3)(#2627)、ME2(#12399)、pan-AcK(#9441)购自美国cell signaling technology公司；

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-苹果酸、Flag 磁株(M2)购自美国sigma公司；转染试剂lipo2000购自美国Thermo Fisher公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒(#S0033)、CCK-8试剂盒(#C0038)和RIPA细胞裂解液(#P0013D)购自于上海碧云天公司。SIRT3 siRNA序列：5′-AAGUCUGGAAUGCCACUGGTT-3′，由上海吉玛公司合成。 ME2 shRNA靶序列为5′-GCACGGCTGAAGAAGCATATA-3′，连接于pLKO.1-puro 载体上。

1.2 方法

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细胞培养 U87MG细胞置于37 ℃、5%CO恒温培养箱中培养；90%DMEM培养基加入10%FBS配制成完全培养基。

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免疫沉淀 本研究主要涉及到的蛋白表达质粒包括ME2野生型(WT)和ME2突变体(K156Q和K156R)。293T细胞转染相应质粒48 h后，加入RIPA细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)，30 min后，12 000 r/min离心20 min，取上清液加入15 μl Flag beads，于4 ℃孵育过夜。……