基质固相分散-气相色谱质谱联用法测定沉香中精油的化学成分

陈虹霞， 周 昊,2， 叶建中， 陶 冉， 李文君, 王成章,2*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042； 2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091)

沉香为瑞香科沉香属(Aquilaria)植物中含有黑色树脂的木质部分，具有极高的药用和收藏价值，是我国以及东南亚地区的传统名贵药材，通常被用作镇静剂。它也是名贵的天然香料，在世界范围内被用作熏香[1]。沉香和沉香精油的研究表明，色酮、倍半萜和芳香性小分子化合物是其主要化学成分[2-3]。目前沉香精油化学成分的研究通常采用乙醚超声波法、乙醚冷浸法、超临界二氧化碳萃取法或水蒸气蒸馏法提取，然后进行检测分析。乙醚萃取法溶剂用量大，而超临界二氧化碳萃取法和水蒸气蒸馏法的样品用量大且提取时间长。基质固相分散(MSPD)是Barker于1989年提出的，在样品制备中得到了广泛的应用，已被证明是一种简单、高效、通用的测定固体和半固体基质中各种分析物的技术[4-6]。MSPD技术将固体样品在介质中与分散剂混合研磨，样品的原始结构被破坏，从而可以释放出分析物。然后将所得混合物加载到层析柱上，用适当的溶剂洗脱分析物。在这种方法中，提取和纯化过程可以集成到一个步骤中，这与其他传统方法不同。集成不仅可以大大减少分析时间和有机溶剂的消耗，而且可以得到满意的富集因子[7]。本研究采用MSPD法对沉香精油进行提取，以沉香化学成分为指标，对吸附基质种类和比例、分散溶剂种类和比例、洗脱溶剂用量等几个影响因素进行优化，得到最佳的MSPD条件。建立沉香精油化学成分检测的基质固相分散-气相色谱质谱联用方法，并将实验结果与乙醚超声波法进行比较，以期为沉香质量评价和后续的调查研究提供一种新方法。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

沉香样品，产自海南，为生物结香方式，样品粉碎成粉末，过0.85 mm的筛，备用。十八烷基硅胶填料(C18)、辛基硅胶填料(C8)购于大连依利特分析仪器有限公司； 硅藻土、硅胶、硅酸镁颗粒、石英砂、甲醇、无水乙醇、正丙醇、异丙醇、正己烷、乙酸乙酯和1,4-二氧杂环己烷(二氧六环)购于国药集团化学试剂有限公司；苄基丙酮购于阿拉丁生化科技股份有限公司；檀香醇购于上海源叶生物科技有限公司；2-(2-苯乙基)色酮购自中国热带农业科学院热带生物技术研究所。GC2014C型气相色谱(GC)仪，日本岛津公司；Agilent-7890型气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪，美国Agilent Technologies有限公司。

1.2 沉香精油的提取

1.2.1基质固相分散提取及单因素试验 称取沉香粉末0.5 g，加入吸附基质和分散溶剂置于研钵中，用研杵使其混匀并研磨完全后，转入到底部垫有脱脂棉的10 mL注射器中。用洗脱溶剂进行洗脱，收集洗脱液，在减压条件下，蒸干溶剂，然后加1 mL的乙醇溶解，过0.45 μm的滤膜，得到供试样品溶液，用GC进行峰面积的检测。沉香精油成分复杂，根据文献[8～10]可知，其精油成分达到45～77种，一方面化合物种类太多，另一方面相当一些化合物没有标准物质可以采购，因此不能完全对所有成分的提取量变化进行研究。沉香精油的主要成分为芳香族化合物、倍半萜和色酮类化合物，最终从芳香族化合物中选择苄基丙酮，倍半萜中选择檀香醇，色酮类化合物中选择2-(2-苯乙基)色酮作为主要分析对象，设计单因素试验，研究不同条件对沉香精油基质固相分散提取的影响。选取了5个因素，分别为吸附基质种类、样品与吸附基质的比例、分散溶剂种类、样品与分散溶剂的比例和洗脱溶剂用量进行基质分散提取试验。考察不同因素对苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮GC检测峰面积的影响。

1.2.2乙醚超声波提取 称取沉香粉末0.5 g，置于100 mL的锥形瓶中，加入乙醚30 mL，在室温下，超声波处理60 min，在减压条件下，蒸干溶剂，然后加1 mL的乙醇溶解，过0.45 μm的滤膜，即为供试样品溶液，用GC进行峰面积的检测[11]。

1.3 精油中3种主要化合物的测定

1.3.1标准样品溶液的制备 将苄基丙酮、檀香醇、2-(2-苯乙基)色酮用乙醇溶解于10 mL的容量瓶中，分别配置成1 g/L的储备液，于4 ℃保存。

1.3.2气相色谱分析 色谱柱为HP-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.32 μm)；程序升温：初始温度为50 ℃，3 ℃/min升至200 ℃，然后5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min，运行时间86 min。载气为高纯氨气，流速为1.0 mL/min，不分流进样，进样体积1 μL，气化室温度250 ℃，检测器温度280 ℃。

通过对比供试样品溶液与标准品的色谱图，确定供试样品溶液气相色谱图中苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮的出峰位置，得到对应的峰面积。

1.4 精油化学成分的GC-MS分析

气相色谱分析条件同1.3.2节。质谱条件：接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，离子源选用EI源，电子能量70 eV，光电倍增管电压220 V，扫描范围29～600 u，质谱库NIST。

2 结果与讨论

2.1 沉香精油基质固相分散提取的影响因素

2.1.1吸附基质类型 吸附基质的类型对MSPD提取起着关键作用，一方面，吸附基质在研磨过程中，可以破坏样品的结构，使目标化合物暴露；另外一方面，可以将化合物固定在吸附基质上，然后通过溶剂提取出来[12]。固定吸附基质与样品(沉香粉末)的质量比为4 ∶1，洗脱溶剂为正己烷/乙酸乙酯(体积比9 ∶1，下同)混合液，洗脱溶剂用量10 mL，分散溶剂为正丙醇，分散溶剂与样品的比例为4 ∶1(mL ∶g),考察7种吸附基质(C18、C8、沙子、硅藻土、硅胶、硅酸镁和石英砂)对苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3个化合物峰面积的影响，结果见表1。从表1可以看出，C8、硅藻土和硅酸镁表现出相似的提取效果，效果较好，而沙子和石英砂的效果最差。这可能是由于沙子和石英砂的颗粒较大，比表面积较小，在吸附目标化合物时，效果不理想。C8、硅藻土和硅酸镁具有较大的比表面积和微孔通道，对这3个化合物的吸附效果较好。C18和硅胶的提取效果欠佳，可能是由于它们与化合物之间形成了较强的氢键结合，使洗脱溶剂难以完全将目标化合物洗脱下来。综合比较，由于硅酸镁对苄基丙酮和檀香醇的吸附效果优于C8和硅藻土，因此选择硅酸镁作为吸附基质用于后续的实验。

2.1.2吸附基质与样品的比例 吸附基质与样品的比例是影响MSPD提取过程的重要因素之一。固定硅酸镁为吸附基质，洗脱溶剂正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脱溶剂用量10 mL，分散溶剂为正丙醇，分散溶剂与样品的比例为4 ∶1(mL ∶g)，考察吸附基质与样品的质量比(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1 和5 ∶1)对苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3个化合物峰面积的影响。从表1可以看出，当质量比增至4 ∶1时， 3个化合物峰面积随之增加，这是由于吸附基质与样品的接触面积增加，从而增强了对化合物的吸附能力。但到5 ∶1时， 3个化合物的峰面积都随之略微下降，可能由于过多的吸附基质，使化合物的洗脱受到阻碍。因此，选择吸附基质与样品的质量比为4 ∶1。

2.1.3分散溶剂种类 分散溶剂的选择是植物精油类样品提取过程中的一个重要参数，分散溶剂既要能与样品中的化合物相似相溶，又要能够与洗脱溶剂混溶。固定硅酸镁为吸附基质，吸附基质与样品的质量比为4 ∶1，洗脱溶剂为正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脱溶剂用量10 mL，分散溶剂与样品的比例为4 ∶1(mL ∶g)，考察5种分散溶剂(甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和1,4-二氧六环)对苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3个化合物峰面积的影响。从表1可以看出，乙醇和异丙醇作为分散溶剂时，化合物的峰面积相对较强。在实验操作过程中，乙醇作为分散溶剂时，样品的萃取过程非常缓慢，需要借助真空系统才能达到。因此，综合考虑，采用异丙醇作为分散溶剂。

2.1.4样品与分散溶剂的比例 固定硅酸镁为吸附基质，吸附基质与样品质量比为4 ∶1，洗脱溶剂为正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脱溶剂用量10 mL，分散溶剂为正丙醇，考察分散溶剂与样品的比例(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1、 5 ∶1和6 ∶1， mL ∶g)对苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3个化合物峰面积的影响。从表1可以看出，随着分散溶剂与样品的比例从1 ∶1增加至4 ∶1， 3个化合物的峰面积随之增加，这可能是由于正丙醇量的增加，可以加速这些化合物的溶出，促进它们在洗脱溶剂中的分散。然而，进一步将正丙醇的量增加至5 ∶1和6 ∶1时，3种化合物的峰面积反而略有下降，可能是由于过量的正丙醇使化合物与吸附基质之间形成强列的相互作用，使化合物不能够完全解吸下来。因此，分散溶剂与样品的比例选择为4 ∶1(mL ∶g)。

表1 不同条件对沉香精油基质固相分散提取的影响

2.1.5洗脱溶剂用量 为了能有效地洗脱精油成分，基本都采用正己烷/乙酸乙酯体积比9 ∶1作为洗脱体系[13-14]。固定硅酸镁为吸附基质，吸附基质与样品质量比为4 ∶1，洗脱溶剂为正己烷/乙酸乙酯混合液，分散溶剂正丙醇，分散溶剂与样品的比例为4 ∶1(mL ∶g)，考察洗脱溶剂用量(2、 4、 6、 8和10 mL)对苄基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3个化合物峰面积的影响。从表1可以看出，随着洗脱溶剂用量的增大，3个化合物峰面积逐渐增大，到6 mL时趋于平稳，说明6 mL的正己烷/乙酸乙酯混合液作为洗脱溶剂，可以达到较好的洗脱效果。

根据以上单因素试验结果，得到沉香精油基质固相分散提取的最佳工艺条件为：硅酸镁为吸附基质，吸附基质与样品质量比为4 ∶1，分散溶剂为异丙醇，分散溶剂与样品的比例为4 ∶1(mL ∶g)，洗脱溶剂为体积比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脱溶剂用量6 mL。在此条件下，进行3次平行试验，沉香精油的提取得率平均值为(9.19±0.15)%，而传统的乙醚超声波提取的得率为(6.65±0.22)%。

2.2 沉香精油的化学组成

2.2.1化学组成分析 基质固相分散提取和乙醚超声波提取的沉香精油的总离子流图见图1，2种提取方法的色谱峰的整体差异不大。基质固相萃取的色谱峰的丰度比乙醚超声波提取的高，这与基质固相萃取的得率大有关。各峰对应的质谱图通过Nist17标准质谱图系统检索，结合质谱图与文献数据对照确定其化学成分，采用峰面积归一化法确定各化合物的含量(以相对峰面积计)，结果见表2。

a.基质固相分散提取matrix solid-phase dispersion; b.乙醚超声波提取ultrasonic assisted ether extraction

表2 不同提取方法所得沉香精油的化学成分

2种提取方法共鉴定出54种主要成分，其中基质固相分散提取和乙醚超声波提取分别鉴定出48和41种。基质固相分散提取的沉香精油中已鉴定的化合物占色谱总出峰面积的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜类占25.67%，色酮类占26.85%，脂肪族占7.50%；乙醚超声波提取的沉香精油中已鉴定的化合物占色谱总出峰面积的77.90%，其中芳香族占3.68%，倍半萜类占25.78%，色酮类占32.83%，脂肪族占11.38%。

2.2.2两种提取方法对比 基质固相分散提取检测出的总化合物的数量略高于乙醚超声波提取，增加的成分主要为倍半萜类化合物，如γ-芹子烯、β-檀香醇、缬草- 4,7(11)二烯、α-愈创木烯、白菖醇和1,9-马兜铃二烯。芹子烯具有泥土或根部的气味；β-檀香醇呈现典型的檀香木香气，带有浓烈的木香和奶香，以及略带尿的气味[15]，这些化合物的存在赋予沉香精油更丰富的香气组成。但2种方法得到的倍半萜类化合物的总含量没有明显区别。在基质固相分散提取得到的沉香精油中，相对分子质量(Mr)小的成分较多，而乙醚超声波提取得到的沉香精油中，Mr大的成分较多。基质固相分散提取沉香精油中色酮类和脂肪族化合物总含量较乙醚超声波提取的精油略低。这可能是由于乙醚超声波提取的主要溶剂乙醚的极性较低，同时鉴于超声波的存在，产生了空化、机械和热效应，可以有效破坏沉香的细胞壁，加速乙醚渗透到沉香细胞中，使得色酮类和脂肪族这些Mr大的化合物能更好地传质和溶出[16-17]。

色酮类化合物是沉香及沉香精油的主要活性成分，也是品质评价的一个重要指标。色酮类化合物在加热裂解时，会产生苯甲醛和对甲氧基苯甲醛，可以产生持久的香味[18]，同时具有多种生物及药理活性，如神经保护[19]、抗肿瘤细胞毒[20]、抑制酶活性[21]、抗菌[22]和抗炎[23]等。沉香中色酮类化合物主要分为4种类型：四氢-2-(2-苯乙基)色酮、环氧四氢-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮和二环氧-2-(2-苯乙基)色酮[24]。采用气相色谱-质谱法从基质固相分散提取和乙醚超声波提取的沉香精油共检测出4种色酮化合物，分别为2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-苯乙基色酮、6,7-二甲氧基-2-(苯基乙基)色酮和6,7-二甲氧基-2-[2 -(4′-甲氧基苯基)乙基]色酮。两种提取方式在色酮类化合物的种类上没有区别，但是乙醚超声波提取的色酮类化合物含量较基质固相分散提取的高。从色酮类含量来看，乙醚超声波提取较优。脂肪族化合物在受到微生物、光、热和空气的作用下，容易氧化形成过氧化物，再分解生成低Mr的酸[25]。从表2的分析来看，乙醚超声波提取的脂肪族化合物的含量较基质固相分散提取的高。而沉香精油中的脂肪族化合物不是越多越好，脂肪族化合物含量较多时，长时间的储存容易使沉香精油发生酸败，产生特殊有刺激性的气味，从而影响沉香精油的品质。因此，从一这方面考虑，基质固相分散提取较优。从精油的化学组成上来看，两种提取方法在主要成分上较一致，主要为芳香族、倍半萜类、色酮类和脂肪族化合物。相比乙醚超声波提取，基质固相分散提取的沉香精油中倍半萜化合物的组成更为丰富。但是乙醚超声波提取的沉香精油中色酮类化合物和脂肪族化合物的含量较高。因此也很难确定两种提取方法哪个更优。从提取过程和得率上来看，基质固相分散提取具有以下优点：1) 提取得率较高；2) 提取过程有机溶剂的用量少，仅为乙醚超声提取的五分之一； 3) 提取过程常温就可以进行，且提取过程对化学成分的破坏小。因此，综上所述，基质固相分散提取结合气相色谱-质谱法能够真实反映沉香精油的化学成分，可作为沉香品质评价的一种快速鉴别方法。

3 结 论

3.1建立了基质固相分散提取沉香精油的方法，通过单因素试验确定了最佳工艺条件：硅酸镁为吸附基质，吸附基质与样品质量比为4 ∶1，分散溶剂为异丙醇，分散溶剂与样品的比例为4 ∶1(mL ∶g)，洗脱溶剂为体积比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脱溶剂用量6 mL。在此条件下，沉香精油的提取得率为(9.19±0.15)%。

3.2采用GC-MS分析了基质固相分散提取沉香精油的化学成分，总共鉴定化合物48种，已鉴定的化合物占色谱总出峰面积的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜类占25.67%，色酮类占26.85%，脂肪族占7.5%，沉香精油化学成分组成与乙醚超声波提取得到的相似。

3.3基质固相分散提取具有提取得率高，溶剂消耗少等优点，进一步结合气相色谱-质谱法能够真实反映沉香精油的化学成分，可作为沉香品质评价的一种快速鉴别方法。