云斑白条天牛肠道木质素降解菌的分离与鉴定

段慧娟，方小英，朱林慧，李贝娜，彭思颖，杨振德

（广西大学林学院 南宁市 530004）

木质素是具有复杂结构的高分子化合物，是由苯丙烷单元结构通过醚键和碳碳键组成的具有三维空间结构的无定型芳香类化合物，与纤维素和半纤维素构成植物骨架的主要成分[1]。其不易降解，但含量丰富，占陆生植物干重15%～40%，是含量仅次于纤维素的生物多聚体[2-3]。木质素作为农作物秸秆以及城市生活垃圾中常见的难降解物质[4]，将其焚烧既产生资源浪费，又造成环境破坏。同时，木质素作为造纸业的副产物，由于难降解，如果直接排放环境中，会造成水生生态系统的破坏[5]。由于存在于细胞壁中的纤维素受到木质素的保护，木质素是否被有效降解对纤维素降解有着重要作用[3]。因此，开发高效降解木质素的技术成为木质纤维素资源化利用与环境保护的重要问题。

目前木质素降解方法主要为物理法、化学法和生物法。微生物降解法具有反应条件温和、成本低、环境友好等特点[6]，成为国内外研究者关注的焦点。其原理为降解木质素的微生物通过氧化断裂木质素侧链Cα-Cβ链，彻底降解产物主要是CO2和H2O[7]。目前研究木质素降解菌株中主要以真菌、细菌为主，真菌中白腐菌对木质素具有强的降解能力，受到广泛关注[6]。然而细菌具有适应性强、来源广，更易于工业化生产等优点，具有广阔的发展前景。细菌通过产酶对木质素进行降解，主要包括3种酶：漆酶、木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶。每个漆酶蛋白分子含有4个铜原子，是漆酶催化反应的活性中心[8]。范晶晶等[9]研究发现金属铜离子和锰离子在合适的浓度能刺激产漆酶，酶活性最高可达263.44 U/L。木质素过氧化物酶主要来源于真菌，在细菌中如链霉菌（Streptomycescinnamomensis）能够分泌过氧化物酶降解木质素，但活性较低。Jing等[10]通过优化培养基组成使过氧化物酶活性得到大幅度提升。

昆虫对地球上所有可利用的物质资源几乎都可以分解，如天牛幼虫蛀食木材，其肠道微生物处于常温中性条件下可对木材消化降解[11]。本研究以云斑白条天牛〔Batocera lineaolata（Chaevroat）〕为研究对象，利用愈创木酚选择性培养基和苯胺蓝平板法，初步筛选其肠道内具有木质素降解功能的菌株，以期为木质素降解菌株资源的开发与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和培养基

样品为云斑白条天牛4龄幼虫，于2018年5月上旬至6月上旬采集于广西国有高峰林场六里分场（108°20′E，22°58′N）的桉树林。

愈创木酚选择培养基[12]：愈创木酚1.0 g，酒石酸铵0.1 g，蛋白胨2.6 g，MnSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，Na2HPO40.2g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.0～7.2，121℃高压灭菌20 min。

苯胺蓝培养基[12]：苯胺蓝0.1 g溶于10 mL蒸馏水，酵母膏10 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至990 mL，分开121℃高压灭菌20 min。

1.2 木质素降解菌的初筛

选取3头云斑白条天牛4龄幼虫，用酒精冲洗并浸泡3 min进行表面消毒。用无菌水冲洗3次。在垂直超净工作台上，用解剖针、解剖剪、镊子解剖取出肠道，将肠道上的脂肪等物质用无菌水冲走后放入玻璃匀浆器，加入1 mL无菌水进行研磨，制成肠道匀浆液。用高速冷冻离心机以5 000 r/min离心5 min。

取稀释103、104、105倍的匀浆稀释液各100μL均匀涂布在愈创木酚选择培养基上，每个浓度3个重复，在30℃的恒温培养箱倒置培养2 d。，待菌落长出后，用接种环从每种稀释梯度的培养基上挑取大小、形态、颜色有差异的单菌落，在新的愈创木酚选择培养基上划线分离4～5次，直至得到单一纯菌落。选择培养基以愈创木酚为唯一碳源，因此，可在该选择培养基上生长的菌落即可初步确定为具有降解木质素能力的细菌。

1.3 木质素降解菌的复筛

将获得的各个纯培养菌株用接种环点种在苯胺蓝培养基上，在恒温培养箱30℃倒置培养2 d后，出现透明水解圈，用游标卡尺测量水解圈直径（D）和菌落直径（d），进行3次重复取平均值，计算水解圈和菌落直径比值（D/d），选择D/d值大的菌株即为降解木质素能力强的菌株。

1.4 木质素降解菌的鉴定

1.4.1 菌株形态观察根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]和《常见细菌系统鉴定手册》[14]对分离所得的菌株进行菌体形态观察、革兰氏染色反应测定。

1.4.2 菌株16SrDNA基因测序

将在30℃的恒温培养箱中倒置培养2 d的菌株接种到液体愈创木酚选择培养基中，30℃振荡培养48 h后，取细菌悬液2 mL，11 500 r离心1 min，倒去上清液。采用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根DP302），按其说明书提取供试菌株的总DNA，用Nanodrop 2 000可见分光光度计测定所提取DNA的OD260/OD280比值，确定DNA纯度和浓度，在DYY-8C电泳仪上用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA是否有降解现象。采用王蕊蕊等[15]的方法，以提取的总DNA为模板，利用细菌16SrDNA的通用引物：正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 反向 引物1 492 R（5’-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3’）进行PCR扩增，PCR反应体系为：12.5μL Eay Taq PCR SuperMix（+dye），1.0μL 27F（10 mmol/L）和1.0μL 1 492 R（10 mmol/L），1.0μL DNA模 板（50 ng/μL）12.5μL ddH2O。反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环；72℃10 min终末延伸；4℃条件下保存。反应完成后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，合格后委托北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。在NCBI平台（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上将测序的结果进行Nucleotide BLAST序列比对，并用MEGA 7.0建立系统发育树，确定菌属分类地位。

2 结果与分析

2.1 菌株形态

在愈创木酚选择培养基上共筛选出37株细菌菌株，其中，B01和B12菌株在苯胺蓝平板上水解圈直径（D）分别为0.95 cm和0.80 cm，菌株菌落直径分别为0.60 cm和0.50 cm，D/d值分别为1.60和1.58，比值最大（图1）。其中菌株B01在愈创木酚培养基上为白色，表面光滑，边缘规则，单菌落呈现圆形，中间颜色较边缘深，不透明。革兰氏染色呈现红色，杆状，可以判定菌株B01为革兰氏阴性菌。菌株B12在培养基上为白色，表面光滑，边缘规则，单菌落呈现圆形，中间凸起，不透明，革兰氏染色呈现红色，球状，判定为革兰氏阴性菌。

图1 菌株B01和B12在愈创木酚选择培养基上的菌落特征及在苯胺蓝培养基上的水解圈

2.2 菌株的16S rDNA序列分析

提取菌株B01和菌株B12的DNA之后，通过细菌通用引物27F-1 492 R进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，所得基因片段如图2所示，条带明亮清晰，均在1 500 bp左右。

图2 菌株B01和B12的PCR扩增产物

据测序结果在NCBI上进行分析比对，选取BLAST中相似度较高的细菌序列，并下载相关序列后，利用MEGA7.0软件的NeighborJoining法构建细菌系统发育树。如图3所示，菌株B01和Pseudo⁃monasbaetica（NR 116 899.1）在同一分支上，因此，将该菌初步判断为假单胞菌属；菌株B02和Kosako⁃nia arachidis（NR 116 403.1）在同一分支上，因此，将该菌初步判断为考氏科萨克氏菌属。

图3 菌株B01和B12的16S rDNA基因序列系统发育树

3 讨论

细菌具有良好的环境适应性与丰富的生物多样性，在强酸、强碱、高温等环境下可以生存，在降解木质素上具有很好的发展潜力[16]。近些年来，细菌降解木质素的研究受到越来越多的关注。降解木质素的细菌主要有厌氧梭菌属（Clostridium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、双芽孢杆菌属（Amphiba⁃cillus）、微球菌属（Micrococcus）等[17]。木质素降解酶系非常复杂，其完整的代谢途径与降解机理尚未明确[16]，代谢途径研究较为明确的主要是以鞘氨醇单胞菌SYK-6为研究对象构建的代谢途径[17]。细菌降解木质素获得大量有用代谢产物，如生物乙醇、生物柴油、沼气、氢气等新能源物质[18]。因此，研究新的木质素降解菌资源，对环境保护、资源利用等具有重要意义。

本研究从云斑天牛肠道内分离获得具有降解木质素能力的细菌菌株2个，分别属于假单胞菌属和考氏科萨克氏菌属。假单胞菌属属于变形菌门（Proteobacteria）假单胞菌科（Pseudomonadaceae）的细菌，考氏科萨克氏菌属属于变形菌门（Proteobacteria）肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌。假单胞菌属是木质素最有效降解者[19]，为油污土壤微生物中的优势菌属[20]，作为非丝状细菌可降解木质纤维素低分子量部分以及木质纤维素的降级产物[21]。有研究发现，假单胞菌属生长温度范围较广，在4℃～43℃均可生长，其多数最适生长温度为30℃，在pH值为7.0～8.5之间生长，生长范围较小[22]。假单胞菌属与其他细菌组成复合菌群可进一步提高木质素降解速率[23]，Ca2+、Mn2+和Fe3+对荧光假单胞菌GcM5--1A胞外木质素过氧化物酶活力有较强的促进作用[24]。

目前关于考氏科萨克氏菌属木质素降解研究较少，未建华[25]从黄翅大白蚁（Macrotermesbarneyi）肠道固氮微生物中分离得到Kosakonia属，其大多为固氮菌[26]。李锋[27]以碱木质素为唯一碳源，从白蚁（Termite）肠道中分离出Kosakonia属。木质素降解酶的合成与活性的强弱受培养基环境的pH影响较大[28]。傅慧静等[28]发现松墨天牛（Monochamusalter⁃natus）肠道中的黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）处于偏酸性环境中过氧化物酶活性较强，陈建军等[29]研究发现黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrys⁃osporium）的漆酶在pH=4时活性较大，可见酸性条件对酶的活性也有较大影响。

本研究从云斑天牛肠道细菌中分离出考氏科萨克氏菌属，丰富了木质素降解菌株资源，为云斑天牛肠道微生物进一步开发利用提供了理论基础。下一步将对假单胞菌属和考氏科萨克氏菌属降解木质素的微观过程、降解机理以及菌株的产木质素降解酶的工业化生产条件等方面开展深入研究。