蔓荆子治疗肝癌的潜在作用机制研究*

卜鑫珏，孙 梅，罗则华

(重庆医科大学附属第三医院/捷尔医院，重庆 401120)

蔓荆子(Viticis Fructus)又名蔓荆实、荆子、万荆子、蔓青子，始载于《神农本草经》，谓“蔓荆实，味苦，微寒。主筋骨间寒热，湿痹拘挛。明目坚齿，利九窍，去白虫。久服轻身，耐老”[1]。蔓荆子是辛凉解表常用中药，善于清利头面诸窍，主要产地为我国东南地区[2-3]。截至目前，国内外专家对蔓荆子的活性成分及药理作用进行了一系列系统研究，蔓荆子的有效成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫应答等作用[4-7]。

肝癌是全球第六大常见侵袭性癌症，也是癌症致死的第三大诱因[8]。亚洲是世界肝癌患者数最高的地区之一，其中中国占世界肝癌人数的50%以上[9]。肝癌的诱发因素很多，包括肝炎病毒感染、酒精性肝损伤、非酒精性脂肪肝疾病、肥胖、糖尿病等。关于蔓荆子及其有效成分可治疗肝癌的研究较多，但其作用的分子机制尚不明确[10-11]。本研究利用网络药理学方法对其潜在的作用靶点、活性成分及相关通路进行分析，为进一步研究蔓荆子治疗肝癌的药理作用提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1蔓荆子活性成分与靶点的筛选 在中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP)输入“Viticis Fructus”检索蔓荆子的化学成分。按照ADME原则结合检索结果，评价药物化学成分在体内的过程，将筛选条件设定为生物利用度(OB)大于30%，类药性(DL)大于0.18，从而获得蔓荆子的活性成分。活性成分对应的潜在作用靶点通过TCMSP的检索功能获得，并通过Uniprot数据库进行转化，得到靶点名称对应的基因符号。

1.1.2肝癌靶点的筛选 利用GeneCards数据库，以“liver cancer”为关键词，检索得到与肝癌相关的作用靶基因。

1.2方法

1.2.1药物-疾病-活性成分-靶点网络的构建 利用R软件绘制韦恩图，取蔓荆子活性成分靶点及肝癌靶点交集，得到蔓荆子抗肝癌的潜在作用靶点。利用Cytoscape3.6.1软件对获取的靶基因和活性成分进行可视化处理，从而构建药物-疾病-活性成分-靶点网络图。

1.2.2蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 利用String数据库，输入蔓荆子的蛋白靶点，选择交互作用大于0.4，限定物种为智人(Homo sapiens)，去除游离节点，构建蛋白相互作用网络。并利用R软件输出可视化柱状图，得到核心靶点。

1.2.3GO功能和KEGG信号通路富集分析 利用DAVID数据库对蔓荆子治疗肝癌的预测靶基因进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。

2 结 果

2.1蔓荆子活性成分及其作用靶点 共筛选到蔓荆子活性成分27种，对应靶点103个，同时筛选到与肝癌相关的靶点5 255个，取交集后共得到潜在作用靶点88个。见表1、2。

表1 蔓荆子治疗肝癌的关键靶点

续表1 蔓荆子治疗肝癌的关键靶点

表2 蔓荆子的关键化合物

2.2药物-疾病-活性成分-靶点网络构建 蔓荆子治疗肝癌具有多成分、多靶点协同作用的特性。27种活性成分中，槲皮素、山柰酚、木樨草素3种活性成分作用靶点较多，分别作用70、28、27个靶点。88个作用靶点中，NCOA2、NCOA1、PGR 3个靶点对应活性成分较多，分别对应18、12、11个活性成分。

2.3蛋白相互作用网络构建与分析 蔓荆子治疗肝癌的潜在靶点的PPI网络中共包含88个节点，897条边，不同靶点对应的“边数”见图1。IL6、CASP3、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1等靶点位于网络的核心位置，在蔓荆子抗肝癌的机制中发挥关键作用。

图1 靶点对应的边数

2.4GO功能和KEGG信号通路富集分析结果 利用DAVID平台进行GO功能富集分析，共得到GO条目334条，其中生物过程230条，分子功能72条和细胞组分32条。按照P<0.5的阈值过滤，KEGG信号通路富集分析共得到76条通路。蔓荆子治疗肝癌的靶点在生物过程方面，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞对过氧化氢的反应、凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、细胞对缺氧的反应、对乙醇的反应等生物过程。细胞组分方面涉及胞质、核质、细胞质、细胞外空间、膜筏、线粒体等。分子功能方面涉及酶结合、蛋白质结合、同源蛋白质的结合、转录因子结合、类固醇结合、特异性DNA序列结合、蛋白质异二聚活性、类固醇激素受体活性等。由KEGG信号通路富集分析可知，蔓荆子治疗肝癌的靶点主要涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、肿瘤坏死因子(TNF)、叉头框转录因子O亚型(FoxO)、核转录因子-κB(NF-κB)、细胞周期、MAPK、HIF-1、P53、VEGF、NOD样受体等信号通路。

3 讨 论

本研究基于疾病-基因-靶点-药物的研究思路，应用网络药理学技术，从分子角度系统阐述蔓荆子治疗肝癌的潜在作用机制。本研究结果显示，蔓荆子有效活性成分有27个，治疗肝癌的作用靶点有88个，其中槲皮素(70个)、山柰酚(28个)、木樨草素(27个)活性成分作用靶点较多；NCOA2(18个)、NCOA1(12个)靶点对应活性成分较多。这些可能是蔓荆子治疗肝癌的关键活性成分和关键作用靶点。多个研究表明，槲皮素、山柰酚、木樨草素均有抗肝癌的作用，其中对应靶点最多的是槲皮素，其可通过调控脂质，活化线粒体，增加细胞抗氧化和胰岛素敏感性，从而发挥保护肝细胞的作用；山柰酚可通过内质网应激和CHOP自噬信号通路诱导肝癌细胞死亡；木樨草素可显著诱导细胞周期在G0/G1期停滞，通过自噬诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡[12-16]。

GO功能富集分析显示，蔓荆子治疗肝癌生物过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞对过氧化氢的反应等生物过程。RNA干扰是一种高效、特异沉默靶基因的新技术[17]，张良鹏[18]研究发现，RNA聚合酶Ⅱ重组hAFP和hTERT双启动子调控siRNA，可特异性抑制肝癌细胞mRNA表达及生长。过氧化氢是一种很强的氧化剂，可诱导机体产生大量的活性氧(ROS)，从而刺激机体产生氧化应激反应。氧化应激反应会破坏多种细胞内分子，包括DNA、脂质和蛋白质等[19]。ROS主要通过激活促炎性转录因子(如NF-κB和激活蛋白-1)直接促进肿瘤，或通过诱导DNA损伤和癌基因激活而间接促进肿瘤的发展[20-22]。LUO等[23]研究发现，过氧化氢对肝细胞的作用呈剂量依赖性，不同水平的过氧化氢可不同程度地抑制肝细胞的生长或增值，甚至可以显著诱导G2/M期的细胞周期停滞。

KEGG信号通路富集分析显示，蔓荆子治疗肝癌主要涉及TNF、P53、HIF-1、FoxO、NF-κB、VEGR、PI3K/Akt、MAPK等信号通路。YU等[24]研究发现，非编码长链RNA SPRY4内含子转录本1(SPRY4-IT1)在肝细胞癌中高度表达，其可促进肝细胞癌中的细胞增殖、细胞侵袭和迁移，诱导细胞周期停滞在G0/G1期并诱导细胞凋亡。TNF是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，MA等[25]通过研究发现，SPRY4-IT1是通过TNF信号通路促进肝癌的进展和转移。WANG等[26]研究证明，银杏叶提取物EGb761通过NF-κB/p53信号通路抑制增殖并触发肝癌细胞凋亡。同时，LIU等[27]研究也证明，HepG2癌细胞的抑制和凋亡机制是通过启动p53信号传导途径(包括外在和内在凋亡途径)的生物学功能介导的。缺氧是肝细胞癌和其他实体瘤的常见特征。重要证据表明，缺氧条件下存活的肝癌细胞比正常条件下生长的细胞更具抗药性[28-29]。ZHANG等[30]研究证明，缺氧环境下HIF-1可通过增加肝癌细胞中的SNAI1转录来促进上皮细胞间质转化。肝癌干细胞经常被激活的关键途径之一是NF-κB信号传导。最新证据表明，脂多糖(LPS)在加重肝细胞癌中起关键作用，是肝脏肿瘤微环境中的重要介体，其通过NF-κB/HIF-1α信号通路来维持肝癌干细胞的特性[31-32]。在肝脏中，FoxO信号通路对于细胞增殖和新陈代谢非常重要[33]，YAMAGUCHI等[34]研究发现，N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂MK-801是通过FoxO信号通路抑制HepG2、HuH-7和HLF细胞增殖。VEGF表达可间接反应肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成情况，并提示肿瘤生长速度和转移倾向[35]。研究显示，丹参酮可以通过抑制VEGF/VEGFR信号通路，将肝癌细胞分裂阻滞在G0/G1期，达到抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的效果[36]。软骨基质低聚蛋白(COMP)会促进皮肤、肺和肝的纤维化。最新的证据表明，COMP在肝细胞癌的发展中起着至关重要的作用[37]。LI等[38]通过研究发现，COMP通过激活肝细胞癌细胞中的PI3K/AKT信号通路，对肿瘤细胞的生长、代谢、增殖及转移进行调节。

综上所述，蔓荆子治疗肝癌具有多成分、多靶点、多途径的特点，其治疗肝癌的主要活性成分是槲皮素、山柰酚，作用靶点主要涉及NCOA2、NCOA1、PGR等。同时，蔓荆子通过RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程，以及TNF、P53等信号通路来发挥治疗肝癌的作用。本研究通过文献调研论述方式对靶点的部分生物功能和通路进行了验证，为今后的基础研究和临床试验提供了理论基础。