球囊菌侵染对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫与解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响

候梦赏, 赵必安, 邱园妹, 万昆林, 梁立强, 李志国, 苏松坤

(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院), 福州 350002)

白垩病是由球囊菌Ascosphaeraapis侵染蜜蜂幼虫引起的一种真菌性病害，蜜蜂幼虫食用被球囊菌孢子污染的食物后，球囊菌孢子在幼虫肠道内萌发生长，感染后期菌丝穿透肠壁，幼虫缩水形成子实体(Jensenetal., 2013)，导致蜂群幼虫大量死亡，群势下降，严重影响蜂群的健康及农牧业的生产(Evans and Schwarz, 2011)。白垩病最早在欧洲的蜂群中发现(Samšiňákováetal., 1977)，20世纪70年代传播到美洲大陆，导致大量蜂群灭亡(Hitchcock and Christensen, 1972)。20世纪90年代在我国浙江出现白垩病，随后经过转地放蜂等活动，迅速在国内暴发，给我国的养蜂业造成了巨大损失(范正友，1996)。经过科学的饲养管理、药物治疗等，蜜蜂白垩病得到了一定的抑制，然而近年来蜜蜂白垩病又有暴发的趋势(Aizenetal., 2009)。

蜜蜂依靠物理化学屏障及先天免疫来抵御外来病菌的入侵，物理屏障主要是表皮与围食膜的作用，化学屏障主要是蜜蜂表皮分泌的蜡质和不饱和脂肪酸，具有一定的抗菌活性(Glinski and Jarosaz, 2001)，先天性免疫主要是细胞免疫与体液免疫，细胞免疫有吞噬作用，包囊和黑色素的形成；体液免疫有抗菌肽的分泌，黑色素化和病原体的酶促降解(Hultmark, 2003; Lemaitre and Hoffmann, 2007)。研究报道蜜蜂对外源性物质的免疫应答通过Toll, Imd, Jak/STAT与Jnk等相互关联的通路诱导抗菌肽的表达(Lemaitre and Hoffmann, 2007)，蜜蜂主要抗菌肽包括Abaecin, Apidaecin, Defensin-1, Defensin-2和Hymenoptaecin 5种，不同的病菌侵染会激活不同免疫通路，导致特定的抗菌肽高表达(Evansetal., 2006)。

蜜蜂进行免疫解毒反应时需要消耗机体新陈代谢产生的能量，机体进行其他的生命活动也要消耗大量的能量(Moret and Schmid-Hempel, 2000)，并且真菌侵染之后，为了其子代的生长繁殖也会与寄主竞争营养物质，增加机体的生存压力(Tsaousisetal., 2008)。糖类是昆虫生命活动中重要的能源物质和中间代谢产物，对机体的正常运行有非常重要的作用；蛋白质作为机体重要的生物大分子，结构蛋白参与生物体的修补与更新，多肽与蛋白质类激素等物质参与个体的免疫、解毒、生长发育等生物进程；脂类物质是生物体内能量最高的营养物质，是蜜蜂蛹期呼吸重要物质，不饱和脂肪酸也是机体生命活动不可缺少的物质(李庆章等, 2016)。各种营养成分协同作用以维持机体正常的生命活动。

前人研究大多关注于球囊菌的侵染过程(李江红等, 2012)及蜜蜂幼虫的转录组学测定(Guoetal., 2019)。关于球囊菌侵染对蜜蜂幼虫肠道中免疫、解毒相关基因和病原基因表达的研究依然较少，此外，被球囊菌侵染蜜蜂幼虫肠道中营养代谢方面的变化依然未知。因此，本研究对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica3日龄幼虫接种球囊菌孢子，收取6日龄幼虫肠道，通过qRT-PCR测定幼虫肠道免疫、解毒、发育相关基因及病原基因的表达量，并测定幼虫肠道蛋白质、脂质、葡萄糖和糖原含量的变化，进一步探索蜜蜂免疫解毒反应与营养物质能量代谢之间的生理联系，以期为后续白垩病的相关机理研究提供理论依据，为养蜂实践中通过调控蜜蜂营养增强蜂群抵御球囊菌侵染的能力打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 蜜蜂球囊菌孢子的纯化培养

参考Foray等(2012)蜜蜂球囊菌的培养方法，制作MY-20培养基。在白垩病高发的季节，从蜂箱门口收集患白垩病的意大利蜜蜂幼虫虫尸，保存于-80℃冰箱中。使用稀释10倍的次氯酸钠溶液清洗白垩病虫尸2次，每次10 min，去除虫尸表面的杂菌；无菌水清洗2次，每次3 min，去除虫尸表面残留的次氯酸钠溶液；使用剪刀将清洗后的虫尸剪成4～5段，置于MY-20培养基上，转移到恒温培养箱中培养，33℃培养3 d即可看到白色菌丝长出；使用接种环将菌丝转接至新的培养基上，以进一步培养纯化球囊菌菌株。蜜蜂球囊菌通过异性菌株接触产生孢子繁殖，使用接种环将不同培养基中的菌丝转接至一个新的培养基上，恒温培养箱中33℃培养7～10 d即可在异性菌株间隙看到黑色孢子产生；收集孢子于1.5 mL离心管中，加入400 μL无菌水，充分研磨破壁，4 000 g离心10 min，去上清液，重复多次，直至球囊菌孢子囊破裂，孢子全部释放，收集孢子悬浮液。采用血球计数法统计孢子液浓度。

1.2 意大利蜜蜂幼虫接种球囊菌

意大利蜜蜂幼虫取自福建农林大学实验蜂场。在3个健康蜂群中使用限王产卵框限王产卵6 h，移取2日龄幼虫至48孔培养板，转至恒温恒湿培养箱中饲养(温度34.5℃，相对湿度95%)，取3日龄幼虫，对照组每头幼虫饲喂50 μL食物(50%新鲜王浆、37%灭菌超纯水、6%葡萄糖、6%果糖和1%酵母提取物)，处理组每头幼虫饲喂50 μL含有2×106孢子/mL球囊菌的上述食物；4日龄和5日龄时对照组与处理组每头幼虫均饲喂相同的不含孢子食物100 μL，每日清理食物残留，更换新鲜幼虫食物。6日龄取样时形态学观察幼虫虫体完整，无明显白垩病发病迹象，幼虫肠道正常，无破碎，无球囊菌菌丝穿透肠壁，拉取蜜蜂幼虫肠道，液氮中冷冻后放入1.5 mL离心管。收集样本在-80℃冰箱中储存，用以后续实验。

1.3 qRT-PCR测定肠道中相关基因表达

通过测定黑蜂王台病毒(black queen cell virus, BQCV)衣壳蛋白(BQCV capsid protein)基因和球囊菌核糖体28S rRNA(Ascosphaeraapis28S rRNA)基因的表达量来表明BQCV和球囊菌在意大利蜜蜂幼虫体内的相对含量。基于本研究的初步实验发现，与BQCV相比，以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)和蜜蜂残翅病毒(deformed wing virus, DWV)在蜜蜂体内的含量较低，通过荧光定量检测后发现，IAPV和DWV的CT值均大于35或者没有任何检测信号值，因而无法获得数据用于后续统计分析。相反，在我们使用的蜜蜂样本中，BQCV在所有蜜蜂样本中均可检测到且CT值均小于31，因此，本研究检测BQCV以说明球囊菌侵染对幼虫肠道中其他病原含量的影响。参考前人已发表的相关引物(表1)检测意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达。取1.2节意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道样本，3个幼虫肠道混合为一个样本，对照组与处理组各取8个样本重复。Trizol法提取幼虫肠道RNA，使用反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)合成cDNA。以Actin和RP49为内参基因。采用SYBR® Premix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)试剂盒进行qRT-PCR反应。配制PCR反应体系(10 μL): SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 模板1 μL, 灭菌水 3.2 μL。所有操作均在冰上进行。PCR反应条件: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环。4℃保存。

表1 qRT-PCR引物

1.4 幼虫肠道蛋白质、脂质和糖类含量的测定

1.4.1蛋白质含量测定：取1.2节意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道样本，3个幼虫肠道混合为一个样本，对照组与处理组各取9个样本重复。每个样本中加入1.5 mL PBS缓冲液，使用高通量组织研磨仪研磨组织(70 Hz 30 s, 2次)，4℃ 600 g离心5 min。取50 μL上清液，加入450 μL PBS缓冲液稀释样本10倍，用PBS缓冲液将蛋白质标准品BSA Standard Solution(2 mg/mL)稀释为1 000, 750, 500, 250, 125和25 μg/mL，取4 μL稀释后的BSA标准品溶液和检测样品溶液加入到96微孔板中；每孔各加入200 μL复温的Bradford Dye Reagent，混匀后在室温下反应5 min；把96微孔板放入酶标仪595 nm波长下检测，绘制标准曲线，计算样品蛋白质浓度，每个样本做3个复孔。

1.4.2脂质、葡萄糖和糖原含量的测定：取1.2节意蜂6日龄幼虫肠道样本，3个幼虫肠道混合为一个样本，对照组与处理组各取9个样本重复。每个样本中加入1.5 mL PBS缓冲液，使用高通量组织研磨仪研磨组织(70 Hz 30 s, 2次)，4℃ 600 g离心5 min。取100 μL上清液加入200 μL PBS缓冲液稀释样本3倍，取180 μL稀释后溶液至新的2 mL离心管中，加入20 μL 20%硫酸钠溶液，加入1.5 mL氯仿甲醇混合溶液(氯仿∶甲醇=1∶2, v/v)，剧烈震荡1 min；4℃ 600 g离心15 min。取100 μL上清液转移至96孔石英板，金属浴90℃完全蒸发，加入20 μL 98%硫酸，封口膜密封。90℃水浴2 min，冰上冷却。加入180 μL香兰素(1.2 g/L)室温孵育15 min，把96孔石英板放入酶标仪525 nm波长下检测，使用三油酸甘油酯做标准品，绘制标准曲线，计算样品脂质浓度，每个样本做3个复孔。

20 μL上清液加入到96微孔石英板，加入230 μL蒽酮试剂(1.42 g/L)，封口膜密封，室温孵育15 min，90℃水浴15 min，把96孔石英板放入酶标仪625 nm波长下检测，使用葡萄糖做标准品，绘制标准曲线，计算样品葡萄糖浓度，每个样本做3个复孔。

取离心后沉淀，加入500 μL 80%甲醇洗涤沉淀，涡旋；4℃ 16 000 g离心5 min，重复洗涤两次。去除上清液，向沉淀中加入1 mL蒽酮试剂；涡旋，过滤膜过滤(d=0.45 μm)，90℃水浴15 min，冰上停止反应，把96孔石英板放入酶标仪625 nm波长下检测，使用葡萄糖做标准品，绘制标准曲线，计算样品糖原浓度，每个样本做3个复孔。

1.4.3标准曲线的绘制：把蛋白质标准品、脂质标准品和糖标准品OD值分别与浓度一一对应，绘制标准曲线，蛋白质(y=1 535x-495.4;R2=0.996)、脂质(y=0.277x-0.03;R2=0.984)、葡萄糖(y=0.558x-0.216;R2=0.985)和糖原(y=0.303x-0.172;R2=0.991)等各标准品线性关系良好，可用于计算肠道样本蛋白质、脂质、葡萄糖、糖原含量的测定。

1.5 数据分析

本实验使用Actin和RP49为内参基因，以两个基因的几何平均数为参考值，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)，以T检验进行差异显著性分析。根据标准曲线计算样本蛋白质、脂质和糖类含量，采用T检验进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道免疫相关基因表达的影响

球囊菌侵染后意大利蜜蜂幼虫肠道免疫相关基因的表达如表2所示，与对照组相比，处理组的LOC406144,Apid1,Def1,Def2,LOC406142,PGRP-SA,Pgrp-s2,PGRP-S3,PGRP-lc,GNBP-1,GNBP3,PPOact,LOC552247,domeless,KAT2A和bsk均显著上调表达(P<0.05)；catus显著下调表达(P<0.05)。

表2 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道免疫相关基因表达的影响

2.2 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道解毒相关基因表达的影响

球囊菌侵染后意大利蜜蜂幼虫肠道解毒相关基因的表达如表3所示，与对照组相比，处理组的Cat,GSTS3,Cyp4g11,LOC725294,Ampka-r1,LOC411223,LOC409791,AmNOS和Sod2均显著上调(P<0.05);CYP6AS14,CPR14,CYP306A1和LOC100576555显著下调表达(P<0.05)。

表3 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道解毒相关基因表达的影响

2.3 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道发育相关基因及病原基因表达的影响

球囊菌侵染后意大利蜜蜂幼虫其肠道发育相关基因及病原基因的表达如表4所示，与对照组相比，处理组的发育相关基因usp呈显著上调表达(P<0.05),VGMC,HEX70b和Vg则显著下调表达(P<0.05)；此外，处理组的病原基因BQCVcapsidprotein和Ascosphaeraapis28S rRNA基因显著上调表达(P<0.05)，也表明球囊菌侵染后蜜蜂肠道内BQCV和球囊菌Ascosphaeraapis相对含量显著上升。

表4 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道发育相关基因及病原基因表达的影响

2.4 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道蛋白质、脂质和糖类含量的影响

与对照组(1.87±0.33 mg)相比，处理组意大利蜜蜂幼虫肠道蛋白质含量(1.58±0.20 mg/肠道)显著降低(T=2.238,df=16,P=0.04)(图1: A)，处理组意大利蜜蜂幼虫肠道脂质含量(0.47±0.075 mg/肠道)比对照组(0.54±0.063 mg/肠道)显著降低(T=2.363,df=16,P=0.031)(图1: B)，处理组意大利蜜蜂幼虫肠道葡萄糖含量(0.36±0.091 mg/肠道)比对照组(0.25±0.099 mg/肠道)显著升高(T=-2.371,df=16，P=0.031)(图1: C)，处理组意大利蜜蜂幼虫肠道糖原含量(0.39±0.039 mg/肠道)比对照组(0.35±0.0359 mg/肠道)显著升高(T=-2.652,df=16,P=0.017)(图1: D)。

图1 球囊菌侵染对意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道蛋白质、脂质和糖类含量的影响

3 讨论

先天性免疫应答的激活涉及到对病原体表面保守结构的识别，即通过宿主细胞编码的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，PRRs包含肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)及革兰氏阴性结合蛋白(Gram-negative binding proteins, GNBPs); PRRs与PAMPs的结合引发了信号级联反应，从而激活细胞免疫反应和抗菌肽的合成，以抵御包括细菌、真菌、病毒和原生动物在内的各种微生物(Zasloff, 2002; Hoffmann, 2003)。蜜蜂的体液免疫中，抗菌肽是重要的组成部分，主要由Toll通路和Imd通路调控。我们的结果显示球囊菌的侵染，提高了抗菌肽基因LOC406144,Def1和Def2表达水平(表2)，这与Aronstein等(2010)的研究结果相类似，证实了Toll通路被激活以转录抗菌肽，来抵御肠道中的球囊菌。虽然Imd通路主要是对革兰氏阴性菌起免疫反应，但研究表明Toll和Imd两个通路之间存在着协同作用(Tanjietal., 2007)，且Nie等(2020)研究蜜蜂幼虫抗性和敏感性个体在感染球囊菌后的转录表达谱，结果显示抗菌肽基因Hymenoptaecin以及Defensin在抗性个体中高表达，这表明球囊菌同样引起了Imd通路的反应。而我们定量结果也显示球囊菌的侵染引起幼虫体内Imd通路的响应，抗菌肽大量产生，抑制负调控Cactus蛋白的表达，使得负调控因子cactus表达降低，同时增加转录因子LOC552247(relish)的表达，最终达到抗菌肽基因Apid1和LOC406142的高表达(表2)。basket是JNK信号组分的同源物，可激活黑化、抗菌和凋亡防御机制(Evansetal., 2006)。basket基因的上调也证实了JNK通路在抵抗球囊菌入侵中具有一定的免疫功能。JAK/STAT通路在果蝇Drosophila对抗病毒上具有重要作用，其次家蚕Bombyxmori上发现感染白僵菌后该通路上相关基因发生上调(Liuetal., 2015; Gengetal., 2016)，说明JAK/STAT也参与对抗真菌的感染，同时东方蜜蜂感染球囊菌后发现该通路上有两个差异基因发生变化(Guoetal., 2019)。Domeless是JAK/STAT通路上的细胞因子受体，在我们的实验结果显示感染球囊菌后编码该受体的基因上调，暗示着西方蜜蜂可能也有着类似的免疫反应。酚氧化酶系统是蜜蜂体液免疫的重要组成部分，外源性物质侵染蜜蜂时，酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)裂解成酚氧化酶，将酪氨酸和多巴胺等物质氧化，产生具有细胞毒性的醌类物质，这些醌类物质形成黑色素聚合体的前体，最后通过黑色素包囊作用消灭入侵微生物(时超美, 2000)，而在球囊菌侵染之后，PPO基因显示为上调。这一系列的结果预示着在被球囊菌侵染后，意蜂幼虫免疫相关基因上调表达，激活Imd, Toll及JAK/STAT等信号通路，抗菌肽大量产生以参与机体的免疫应答反应。

蜜蜂等昆虫主要依靠氧化反应对外源性物质进行解毒，球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫很可能会引起幼虫的氧化应激反应(Lietal., 2020)。本实验结果表明球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后其肠道解毒相关基因Cat,GSTS3,Cyp4g11,LOC725294,Ampka-r1,LOC411223,LOC409791,AmNOS和Sod2与对照组相比均显著上调，CYP6AS14,CPR14,CYP306A1和LOC100576555显著下调表达(表3)。过氧化氢酶与果蝇抗氧化损伤时细胞防御有重要作用(Sun and Tower, 1999)。谷胱甘肽转移酶是一种多功能酶，可对内源性和外源性化合物进行解毒，并与果蝇幼虫中肠的氧化应激反应有关(Lietal., 2008)。细胞色素和蛋白激酶是昆虫体内重要的解毒性酶参与机体的氧化反应。在本研究中，与对照组相比，球囊菌感染的幼虫肠道中的Cat,GSTS3和Ampka-r1等基因显著上调表达，证明球囊菌侵染会导致解毒相关基因上调表达，增强蜜蜂幼虫的氧化反应，影响蜜蜂幼虫的氧化应激能力。

球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后测定其肠道发育相关基因及病原基因表达量，结果表明处理组意大利蜜蜂幼虫肠道内球囊菌Ascosphaeraapis28S rRNA基因比对照组显著上调表达(表4)，说明含有大量球囊菌，对照组意大利蜜蜂肠道内无球囊菌，证明实验接种成功，后续实验合理。球囊菌侵染后可能会破坏意大利蜜蜂个体免疫解毒系统，降低意大利蜜蜂对病毒防御能力，进而导致被球囊菌侵染幼虫肠道内BQCV病毒含量显著上升。与对照组相比发育相关基因usp显著上调表达，VGMC,HEX70b和Vg显著下调表达。超气门蛋白USP是核受体的一员，一般是与相应的配体形成二聚体来介导激素的级联反应，如与蜕皮激素受体形成异源二聚体结合蜕皮激素，进而调节发育变态、免疫等过程(Barchuketal., 2004)。Flatt等(2008)使用蜕皮激素处理大肠杆菌侵染的昆虫细胞以及果蝇幼虫后，发现相应的抗菌肽基因表达均表现出上升的趋势，随后通过RNA干扰相应的核受体EcR或USP无法表达，结果表明usp在蜕皮激素调控昆虫免疫功能的过程中式必不可少的，这与我们的结果相对应。HEX70b功能是一种储存蛋白，用于储存营养物质，在幼虫期大量合成为蛹期变态发育提供营养(Burmester and Scheller, 1999)。本研究结果表明球囊菌侵染导致相应的调控营养代谢的基因呈下调表达，推测可能会争夺幼虫肠道内的营养物质。卵黄原蛋白是昆虫体内重要的功能蛋白，参与昆虫的免疫应答，行为调节与寿命。Singh等(2013)研究表明卵黄原蛋白能抑制细菌的繁殖，可增强蜜蜂免疫力并参与免疫应答的启动(Harwoodetal., 2019)。本研究结果表明球囊菌侵染后降低意大利蜜蜂幼虫的卵黄原蛋白基因Vg及HEX70b表达水平，影响意大利蜜蜂幼虫的免疫应答及个体发育。

本研究结果表明球囊菌侵染后，意大利蜜蜂幼虫肠道蛋白质与脂质含量显著下降,而葡萄糖与糖原含量显著上升(图1)。Aronstein等(2010)通过转录组测序研究表明球囊菌侵染后影响蜜蜂的转录调控、泛素化蛋白的凋亡降解、营养调控和RNA加工相关的关键功能。Li等(2018)研究表明东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae感染意大利蜜蜂后影响其蛋白质含量，减少宿主蛋白质的合成可能是真菌抑制宿主进行免疫应答的一种策略，蛋白质合成的减少会影响意大利蜜蜂下游的生理途径，如保幼激素的生理调节。卵黄蛋白原是一种与应激反应相关的重要蛋白，可以与保幼激素相互作用，影响蜜蜂下游的生理行为(Guiduglietal., 2005)。本研究结果表明球囊菌侵染后，意大利蜜蜂幼虫肠道蛋白质含量与卵黄蛋白原基因Vg表达均显著下调。蜜蜂脂质流失机制与进化保守的调节营养和能量代谢的分子信号通路有关，主要包括卵黄蛋白原、保幼激素、胰岛素、胰岛素生长因子、章鱼胺等信号分子的调节(Amentetal., 2011)。与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂相似(Lietal., 2018)，球囊菌侵染也会降低意大利蜜蜂脂质的含量，球囊菌和东方蜜蜂微孢子虫同属蜜蜂真菌类病害，侵染蜜蜂后，需要从寄主获取生长与繁殖的能量，脂质作为生物体含能量最高的物质，真菌可能会与宿主竞争营养物质，从而加速蛋白质与脂质含量的损失，进而影响意大利蜜蜂的免疫应答。本研究结果显示球囊菌胁迫意大利蜜蜂幼虫后，葡萄糖及糖原含量显著上升。Li 等(2020)研究表明球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后，代谢组测定显示糖原含量显著上升，与本研究结果相似。球囊菌胁迫可能会影响意大利蜜蜂的能量应激反应，导致幼虫感受到与碳水化合物相关的能量压力，加速能量储备，以应对病原体诱导的能量应激。

综上，本研究从免疫、解毒、发育相关基因和病原基因表达及蛋白质、脂质、葡萄糖、糖原等营养成分含量来揭示球囊菌侵染对意大利蜜蜂幼虫的影响，结果表明球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后影响其免疫、解毒、发育相关基因和病原基因表达，影响意大利蜜蜂的能量应激反应，加速蛋白质、脂质的损失及葡萄糖和糖原能量储备，影响机体正常的生理活动。