小麦赤霉病菌拮抗菌XG-6的分离鉴定及其应用

马东方, 卢涛, 詹闯, 金莹莹

1.主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心(长江大学)，湖北 荆州 434025 2.长江大学农学院，湖北 荆州 434025

在我国，小麦赤霉病是一种由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引发的禾谷类作物重要病害[1,2]。禾谷镰刀菌为半知菌亚门真菌，是一种常见的镰刀菌[3-5]。因为喜温喜潮湿的生长习性，由其内膜导致的赤霉病也广泛分布于全球温暖潮湿半潮湿的地区[6,7]。我国华中地区和华南地区气候相对潮湿，十分适合禾谷镰刀菌的生存繁殖，因此在长江中下游和江淮地区的小麦种植地区小麦赤霉病的发生尤为严重[8]。最近几年，已有报道小麦赤霉病向北蔓延的趋势有所增加，在我国西北和东北等地常有发生[9,10]。而且，随着小麦机械收割技术的不断提高，小麦赤霉病的发生次数更加频繁，发病程度愈发严重[11,12]，对我国麦类作物生产产生巨大影响。小麦赤霉病在我国的发病比例已高达25%，我国各地小麦产区深受小麦赤霉病危害[13,14]。小麦赤霉病主要在开花期侵染小麦穗部，灌浆期致病，严重影响小麦产量与质量，一般使小麦减产40%～60%[15]。禾谷镰刀菌在侵染过程中会产生主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)等毒素类的单端胞霉烯族毒素(trichothecenes)，且主要累积在小麦的麦粒中[16]，严重影响小麦的品质，甚至危害人畜健康[17,18]，严重时可致人畜死亡[19,20]。上述研究指出DON会导致小鼠中的核糖毒性应激反应，对暴露于DON的动物产生负面影响，对人畜造成危害[21-23]。

目前，田间管理与化学农药的使用是防治病虫草害的主要手段，但化学药剂的长期单一化使用造成了一系列不良后果，如抗药性增强、农药残留和环境污染等[24]。生物防治在解决这些问题方面发挥了关键的作用[25]。通过筛选针对小麦赤霉病的高效拮抗菌株研发生物防治药剂成为研究热点。芽胞杆菌因为其适应性强、应用潜力大[26]，在病害生物防治研究中已经取得显著成果[27]。国内外学者已有许多关于小麦赤霉病的生防研究，筛选到的对禾谷镰刀菌有拮抗作用的菌株多以芽胞杆菌、假单胞菌、放线菌等为主。在CHRISTIAN等[28]的研究中，生防细菌与氧化锌纳米粒子结合后可显著抑制禾谷镰刀菌的生长繁殖；HERRERA等[29]分离得到芽胞杆菌菌株5c，通过形成生物膜对赤霉病菌具有明显的拮抗作用。HE等[30]从土壤中分离出小麦赤霉病的拮抗菌株，可使赤霉病病害程度显著下降；ZHAO等[31]分离鉴定所得的菌株SG6(枯草芽胞杆菌)对禾谷镰刀菌病菌胞子的萌发抑制率高达95.6%；李峰等[32]从小麦中分离得到HB022菌株属于多黏类芽胞杆菌，对小麦赤霉病有显著的防治效果；裴韬等[33]得到了枯草芽胞杆菌P72，在其细胞液中分离出的拮抗物质可显著抑制禾谷镰刀菌生长；辛海峰等[34]分离得到对赤霉病具有较高防治作用的萎缩芽胞杆菌菌株XM；冉军舰等[24]从田间土壤中分离出禾谷镰刀菌拮抗芽胞杆菌菌株7M1。上述研究表明，利用植株内分离得到的真菌对小麦赤霉病进行生物防治具有较高的应用潜力和可行性。

笔者以湖北荆州市荆州区农高区小麦赤霉病发病地区扬花期健壮的小麦植株为试验材料，分离、筛选材料的内生菌，最终得到拮抗效果较强的内生菌XG-6，并对其拮抗谱、耐药性等进行了研究，旨在为利用该拮抗菌株生物防治小麦赤霉病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试植株与取样方法

选取湖北省荆州市发生小麦赤霉病田块中的健壮小麦，采用5点取样法整株取样，将整株小麦样品放入无菌袋中保存，带回实验室分离内生菌。

1.2 供试植物病原菌

供试的植物病原菌均由长江大学农学院植物病原真菌与基因组学研究室提供，菌株包括禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、火龙果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)和梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)。

1.3 内生菌的分离

将小麦的茎和叶剪成5cm左右的小段，与穗粒一起，用水冲洗30min。以下操作均需要在超净工作台进行。将小麦各部位切成0.5cm×0.5cm的组织块，用75%酒精(乙醇)消毒1min，然后用4%次氯酸钠消毒3min，再次用75%酒精(乙醇)消毒30s，最后用ddH2O清洗3遍，置于已灭菌的滤纸上吸干，每皿6块组织块均匀放置在PDA培养基上培养[35,36]。

1.4 拮抗细菌的筛选

图1 离体拮抗试验示意图 Fig.1 The schematic of in vitro antagonism test

使用平板对峙法[37]在直径90mm的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板中央接种直径5mm的小麦赤霉病菌菌饼，按图1所示在小麦赤霉病菌菌饼周围接上纯化后的内生菌，以空白培养基作为空白对照，每个处理设置3个重复，放入28℃等温培养箱培养3～4d，待空白对照长满整个培养皿时，根据抑菌圈直径计算拮抗效果[35,36]。

1.5 拮抗菌株XG-6培养条件的研究

选用平板对峙法[37]测定拮抗菌株XG-6对4种病原真菌(白绢病菌、棉花立枯病菌、火龙果炭疽病菌、梨黑斑病菌)的拮抗作用。利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖作为碳源(碳源利用基础培养液：(NH4)2SO42.0g，NaH2PO4·H2O 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.1g，蒸馏水1000mL，pH=7.0)，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸铵作为氮源(氮源利用基础培养基：KH2PO41.36g，NaHPO42.13g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.5mg，CaCl25mg，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH=7.0)，检测菌株XG-6的碳源与氮源的利用情况，待其在培养基上生长3d后测定其温度及pH生长曲线、耐药性以及明胶液化、淀粉水解、酪蛋白水解等特征[38]。

1.6 拮抗菌株XG-6的鉴定

使用改良的CTab法[39]提取菌株XG-6的基因组DNA，并用16S rDNA的通用引物(正向引物：27F；反向引物：1492R)进行PCR扩增。将PCR产物送至南京金斯瑞公司测序，测序结果通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST比对，明确菌种种类。

1.7 培养箱条件下XG-6对赤霉病防治效果的测定

选取尺寸相同且颗粒饱满的小麦种子进行消毒：①70%乙醇漂洗10s；②2%次氯酸钠浸泡25min；③ddH2O清洗3～5遍。拮抗菌XG-6在PDA平板上培养至菌丝铺满整个培养基，然后用ddH2O洗下制成菌悬液。赤霉菌用绿豆培养基摇菌7～10d。

消毒后的种子分成3份后作为3个处理组进行试验：①对照：使用ddH2O浸种12h，并且不接种赤霉菌；②生理盐水+赤霉菌：使用ddH2O浸种12h，然后接种赤霉菌；③赤霉菌+拮抗菌：使用XG-6的菌悬液浸种12h，然后接种赤霉菌。催芽后在20℃、16h/8h(白天/夜晚)培养箱中培养。分别在播种第15天和第25天时统计发病苗数，并计算发病率(发病率=发病苗数/总苗数×100%)，同时称量第25天时每盆麦苗的鲜重和干重。

2 结果与分析

2.1 拮抗内生菌的筛选

根据菌落形态的差异性，经过平板对峙法测定，从中筛选出7株对小麦赤霉病菌有拮抗作用的内生菌，经差异显著性比较，结果显示有差异(P<0.01)(见表1)。其中，菌株XG-6的抑菌圈的直径达31.19mm，因此选取XG-6菌株用于进一步研究。其对小麦赤霉病菌的拮抗效果如图2所示。

表1 分离到的拮抗菌抑菌圈直径及其来源

图2 拮抗菌株XG-6对小麦赤霉病菌的拮抗效果 Fig.2 Antagonistic effect of antagonistic strain XG-6 on wheat Fusarium graminearum

2.2 XG-6菌株的拮抗谱

XG-6菌株对4种供试病原菌的生长均有抑制效果(见表2)，为广谱性拮抗菌，其中对火龙果炭疽病菌的抑菌圈直径为35.93mm，抑制效果最好。

表2 拮抗菌株XG-6对4种病原菌的拮抗效果

2.3 XG-6拮抗菌株的培养条件

XG-6的生长曲线图、最适温度生长曲线图和最适pH生长曲线图如图3所示。结果表明，XG-6菌株在接种到营养琼脂培养液后的24h内为对数生长期,24～72h内为稳定期,72h后进入衰退期；XG-6菌株能在10～50℃环境下生长，适宜生长的温度为25～30℃；XG-6菌株pH在3～10范围内均能生长，其中适宜生长的pH范围为6～9，pH为3时基本不生长。

图3 XG-6的生长曲线图、最适温度生长曲线图和最适pH生长曲线图Fig.3 Growth curve, optimal temperature growth curve and optimal pH growth curve of XG-6

XG-6菌株的生理生化特征如表3所示。XG-6菌株可将蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖作为碳源，将蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸铵作为氮源，且XG-6的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，其淀粉水解及明胶水解都呈阳性但酪素水解呈阴性。

表3 XG-6菌株的生理生化特征

2.4 XG-6拮抗菌株耐药性测定

拮抗菌XG-6耐药性测定结果如表4所示，拮抗菌XG-6在加入不同抗生素的培养基中培养2d后的生长情况如图4所示。试验结果表明，XG-6拮抗菌株对于氯霉素、氨苄西林钠2种抗生素表现极强的耐药性，对四环素也具有一定的耐药性，而对链霉素和卡那霉素的耐药性相对较弱。

表4 拮抗菌XG-6耐药性测定结果

图4 拮抗菌XG-6在加入不同抗生素的培养基中培养2d后的生长情况Fig.4 Growth of antagonistic becteria XG-6 cultured in medium with different antibiotics for 2d

2.5 拮抗菌XG-6鉴定结果

测序结果表明，XG-6菌株的16S rDNA序列含有1509个碱基。将该序列上传至NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，进行BLAST比对，结果显示XG-6菌株初步被判断为芽胞杆菌(Bacillus)。根据BLAST的结果，构建系统发育树(见图5)。结果显示XG-6与解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有93%的相似性，可以将研究所分离的菌株XG-6认定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

图5 XG-6菌株的16S rDNA序列系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of strain XG-6

2.6 培养箱条件下XG-6对赤霉病的防治效果

将实验室筛选出的拮抗菌株XG-6施用于麦苗上，观察其抗赤霉病的效果。蒸馏水+赤霉菌的处理在第15天和第25天时的发病率分别为56.33%和82.67%，使用XG-6+赤霉菌处理的小麦在第15天和第25天时的发病率分别为36.00%和51.67%(见图6(a))，拮抗菌株XG-6降低了赤霉病的发病率。与蒸馏水+赤霉菌处理相比，XG-6+赤霉菌处理的鲜重质量较高，干重质量变化较小(见图6(b))。

图6 培养箱条件下XG-6对赤霉病的防治效果Fig.6 Control effect of XG-6 on Fusarium head blight under incubator condition

3 讨论与结论

解淀粉芽胞杆菌于1943年首次在日本土壤中被发现[40]，该菌隶属芽胞杆菌属[41]，是一种嗜温好氧细菌，在自然界中广泛存在。因其繁殖速度快、生命力较强、安全性高对人畜无害并具有非常强的抗逆性等特点[42]，非常适于作为生物防治菌种，深受广大科研人员的重视。研究表明解淀粉芽胞杆菌会产生抗菌蛋白或胞外水解酶等物质直接抑制和破坏病原菌[43,44]。一些学者认为，解淀粉芽胞杆菌会诱导寄主植物产生抗病性，进而抵抗其他病害的入侵，还有可能是因为解淀粉芽胞杆菌本身体积较大，会与病原菌竞争相应的生存空间并且其繁殖速度较快会快速抢占植物的营养物质，使病原菌无法生长。

目前有关解淀粉芽胞杆菌用于防治植物病害的研究很多，并且市场上已有了一些拮抗菌制成的商品[45]。冯志敏等[46]分离出枯草芽胞杆菌和蜡状芽孢杆菌菌株对葡萄灰霉病具有抗性。刘仕飞等[47]分离出拮抗小麦纹枯病的细菌菌株XZ18-3。郝建安等[43]得到的NK10.BAhjaWT菌株对水稻纹枯病菌、黑曲霉、黑痘病菌等多种病原菌的拮抗作用均较好。孟利强等[48]也从大豆中分离到了菌株TF28。由此可见，解淀粉芽胞杆菌对病原菌的拮抗作用具有非常好的应用前景。

该研究从湖北省荆州市小麦赤霉病发病地区采集1株健康小麦植株，分离得到了拮抗菌株XG-6，通过16S rDNA序列鉴定为解淀粉芽胞杆菌。结果表明，该菌株对小麦赤霉病菌具有效果显著的拮抗作用的同时，对所测试的4种病原菌(火龙果炭疽病菌、棉花立枯病菌、白绢病菌、梨黑斑病菌)都有良好的拮抗作用，具有广谱性，且对于3种抗生素氯霉素、链霉素、氨苄西林钠有极强的耐药性。蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖可作为XG-6菌株的碳源，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸铵可作为氮源，培养条件要求相对不高，易于培养。在培养箱的条件下XG-6菌株抗赤霉菌的效果明显。

该研究均在实验室条件下完成，在实际生产中，XG-6产生的拮抗物质能否在自然条件下发挥良好的拮抗作用，以及拮抗菌株XG-6产生何种拮抗物质、拮抗物质的理化性质等尚不清楚，这些问题都有待进一步研究。