阿利吉仑对大鼠急性肝衰竭的保护作用及机制研究

李晓青 陈云茹 张 曦 叶 峰 蔺淑梅 李建州

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是在无慢性肝病基础上短时间内发生大量肝细胞坏死及严重肝功能损害，进展迅速，病死率高，目前尚缺乏特效治疗药物[1]。研究发现，人体内的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)和肝脏局部RAS的激活与脂肪肝、慢性肝炎和肝硬化密切相关，为肝脏疾病的治疗提供了新的思路，但关于RAS在肝衰竭中的研究报道甚少[2,3]。阿利吉仑是第2代肾素抑制剂，能够直接降低肾素的活性，减少血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)生成，在第一环节阻断RAS系统[4]。因此推测阿利吉仑可以通过阻断RAS对急性肝衰竭发挥保护作用。本研究通过D-GalN/LPS联合注射诱导大鼠急性肝衰竭模型，采用阿利吉仑进行干预，探讨阿利吉仑对急性肝衰竭的保护作用及其分子机制。

材料与方法

1.实验动物及主要试剂：体质量180～200g的清洁级雄性8周龄SD大鼠，由西安交通大学医学院动物中心提供，本研究在西安交通大学医学院生物医学伦理学委员会审批后实施(伦理许可证编号：2017-606)。D-GalN与LPS购自美国Sigma-Aldrich公司。阿利吉仑购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。AngⅡ、血管紧张素(1-7)[angiotensin1-7，Ang(1-7)]、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)、转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。TUNEL凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。RNA提取试剂、荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)一抗购自艾博抗(上海)贸易有限公司，二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。

2.实验分组：将30只清洁级健康SD大鼠按随机数字表法分为3组：①正常对照组：10只，腹腔注射0.9%氯化钠注射液，30min后再次注射等量0.9%氯化钠注射液；②肝衰竭组：10只，腹腔注射0.9%氯化钠注射液，30min后腹腔注射D-GalN(0.8g/kg)/LPS(10μg/kg)；③阿利吉仑组：10只，腹腔注射阿利吉仑(25mg/kg)，30min后腹腔注射D-GalN(0.8g/kg)/LPS(20μg/kg)。所有实验大鼠10h后统一处死，采血分离血清，同时留取肝脏右叶组织，冻存备检。

3.生化指标及炎性细胞因子的检测：采用全自动生化分析仪(型号：Rayto Chemray 240)检测大鼠血清中的ALT、AST、LDH、ALP水平。按照试剂盒说明书采用Elisa法检测大鼠血清或肝组织中TNF-α、IL-6、TGF-β1、AngⅡ、Ang(1-7)水平。

4.HE染色：获取大鼠肝脏右叶组织后放入10%甲醛溶液中固定72h，经组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋、切片、烤片、切片脱蜡、苏木精染色、伊红染色等常规步骤，200倍光镜下观察肝脏病理变化并拍照。

5.TUNEL法检测肝脏细胞凋亡：采用TUNEL法检测大鼠肝右叶组织中肝细胞凋亡指数。在荧光显微镜下观察采集图像，与细胞核重叠且呈红色荧光的为阳性细胞。运用凋亡指数表示，选取5个400倍镜下视野，每个高倍视野计数100个细胞，计数各视野的凋亡指数。凋亡指数(%)=各视野阳性细胞数/100×100%，每个大鼠的凋亡指数等于各视野凋亡指数的平均值。

6.荧光定量PCR分析：每组随机选择5只大鼠的肝右叶组织进行检测，采用Trizol法提取肝脏组织的总RNA，反转录成cDNA，应用ABI 7500荧光定量PCR仪进行反应，数据以2-△△Ct进行分析。β-actin上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，扩增条带为240bp。GRP78上游引物：5′-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3′，下游引物：5′-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3′，扩增条带为195bp。CHOP上游引物：5′-CCCCAGGAAACGAAGAGGAA-3′，下游引物：5′-CGCACTGACCACTCTGTTTC-3′，扩增条带为210bp。

7.Western blot法检测：每组随机选择5只大鼠的肝右叶组织进行检测，用裂解液提取肝脏组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取50μg样本进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜上，用含5% 脱脂奶粉的封闭液室温摇床封闭2h。PVDF膜浸泡于封闭液稀释的一抗中4℃孵育过夜。TBST洗膜后，PVDF膜浸泡于封闭液稀释的二抗37℃摇床孵2h。TBST洗膜后用ECL液显色检测蛋白信号。用BandScan图像软件分析各阳性条带的积分灰度值，分别计算GRP78、CHOP与内参β-actin的灰度值之比作为其相对含量值。

结 果

1.3组大鼠RAS关键分子的变化：与正常对照组比较，肝衰竭组大鼠血清和肝脏组织的AngⅡ水平均明显升高，肝脏组织的Ang(1-7)水平明显下降，而AngⅡ/Ang(1-7)比值明显升高(P=0.000)。与肝衰竭组比较，阿利吉仑组大鼠血清和肝脏组织的AngⅡ水平均明显下降，Ang(1-7)水平明显升高，而AngⅡ/Ang(1-7)比值明显下降(P=0.000)，详见表1和表2。

表1 3组大鼠血清中RAS关键分子的变化

表2 3组大鼠肝组织中RAS关键分子的变化

2.3组大鼠生化指标的变化：与正常对照组比较，肝衰竭组大鼠血清的ALT、AST、LDH、ALP水平明显升高(P=0.000)。与肝衰竭组比较，阿利吉仑组大鼠血清的ALT、AST、LDH、ALP水平明显下降(P<0.01)，详见图1。

图1 3组大鼠生化指标的变化A.3组大鼠血清ALT的变化；B.3组大鼠血清AST的变化；C.3组大鼠血清LDH的变化；D.3组大鼠血清ALP的变化。*P<0.05，**P=0.000

3.3组大鼠炎性细胞因子浓度的变化：与正常对照组比较，肝衰竭组大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β1水平明显升高(P=0.000)。与肝衰竭组比较，阿利吉仑组大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β1水平明显下降(P=0.000)，详见图2。

图2 3组大鼠炎性细胞因子浓度的变化A.3组大鼠血清TNF-α的变化；B.3组大鼠血清IL-6的变化；C.3组大鼠血清TGF-β1的变化。*P<0.01，**P=0.000

4.3组大鼠肝组织病理的变化：在200倍光镜视野下可见，与正常对照组比较，肝衰竭大鼠的肝脏组织HE染色后可见部分肝小叶结构紊乱，肝窦淤血，大量肝细胞变性坏死及炎性细胞浸润。与肝衰竭组比较，阿利吉仑组仍可见炎性细胞浸润和肝窦淤血，但肝细胞的变性坏死明显减少，肝实质细胞数量明显增多，详见图3。

图3 3组大鼠肝脏组织HE染色(×200)A.正常对照组；B.肝衰竭组；C.阿利吉仑组

5.3组大鼠肝组织细胞凋亡的变化：在200倍荧光视野下可见，与正常对照组比较，肝衰竭大鼠的肝脏组织出现大量细胞核染成红色荧光的凋亡细胞，而阿利吉仑组大鼠肝脏组织内凋亡细胞数量较肝衰竭组明显减少，详见图4。与肝衰竭组比较，阿利吉仑组大鼠肝脏组织中肝细胞的凋亡指数明显下降(P=0.000)，详见表3。

表3 3组大鼠肝组织凋亡指数的比较

图4 3组大鼠肝脏组织TUNEL染色(×200)A.正常对照组；B.肝衰竭组；C.阿利吉仑组

6.3组大鼠肝脏组织GRP78、CHOP表达水平的变化：荧光定量PCR分析结果显示，与正常对照组比较，肝衰竭组大鼠肝脏组织中GRP78、CHOP的 mRNA表达水平明显上调(P=0.000)。与肝衰竭组比较，阿利吉仑组肝脏组织中GRP78、CHOP的 mRNA表达水平明显下调(P=0.000)，详见图5中A和B。Western blot法检测结果显示，3组大鼠肝脏组织中GRP78、CHOP蛋白的水平与mRNA的表达水平趋势一致(P=0.000)，详见图5中C～E。

图5 3组大鼠肝组织GRP78、CHOP表达水平的变化A.3组大鼠肝组织GRP78 mRNA水平的变化；B.3组大鼠肝组织CHOP mRNA水平的变化；C.3组大鼠肝组织GRP78蛋白水平的变化；D.3组大鼠肝组织CHOP蛋白水平的变化；E.3组大鼠肝组织Western blot法检测结果。*P=0.000

讨 论

RAS系统是人体内重要的内分泌系统，其发挥生物学作用主要通过两条功能轴，即血管紧张素转换酶-血管紧张素Ⅱ-血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin converting enzyme- angiotensinⅡ-angiotensinⅡ type1 receptor，ACE-AngⅡ-AT1R)轴和血管紧张素转换酶2-血管紧张素(1-7)- Mas受体[angiotensin converting enzyme2- angiotensin1-7- mas receptor，ACE2- Ang(1-7)-MasR]轴。既往研究表明，ACE-AngⅡ-AT1R轴参与调控多种炎症相关的病理过程，主要发挥促炎、促氧化应激及促凋亡等负面效应[5～9]。而ACE2-Ang(1-7)-MasR轴作为拮抗轴，则发挥抗炎、抗氧化应激及抗凋亡化等正面效应[10,11]。RAS已被证实参与肝炎、肝纤维化等多种肝脏疾病的病理过程，但在肝衰竭中的具体作用机制尚不清楚[12,13]。本研究发现，在急性肝衰竭进程中，RAS的核心效应分子AngⅡ和Ang(1-7)呈现相反的变化趋势，AngⅡ/Ang(1-7)比值明显升高，提示存在ACE-AngⅡ-AT1R轴过度激活。而阿利吉仑干预可以显著降低ACE-AngⅡ-AT1R轴的激活水平，同时提高ACE2- Ang(1-7)-MasR轴的激活水平，从而纠正两条功能轴失平衡状态，发挥其保护作用。

炎症和凋亡是急性肝衰竭进展中肝脏的特征性病理改变[14]。本研究发现，LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭大鼠在10h后即出现严重的肝功能损伤和炎性细胞因子风暴，表现为血清中ALT、AST、ALP、LDH等生化指标以及TNF-α、IL-6、TGF-β1等经典炎性细胞因子水平的显著升高，同时组织中可见大量肝细胞变性坏死和凋亡肝细胞。而在造模前给予阿利吉仑干预，则可以明显减轻急性肝衰竭大鼠的肝功能损伤和炎性细胞因子风暴，同时组织中肝细胞变性坏死、凋亡明显减少。以上研究结果表明，肾素抑制剂阿利吉仑能够通过阻断RAS发挥抗炎、抗凋亡效应，对急性肝衰竭具有保护作用。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)与各种急性或慢性的肝脏疾病的发生和发展密切相关，包括非酒精性脂肪肝、药物性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等[15～18]。已有研究证实，在急性肝衰竭进程中，存在严重的ERS，而抑制ERS可以减轻急性肝衰竭动物的肝功能损伤[19]。本研究发现，阿利吉仑干预后肝衰竭大鼠肝脏组织中ERS标志分子GRP78 和CHOP的表达水平明显下调，提示阿利吉仑可能通过抑制内质网应激发挥保护作用。但是，在急性肝衰竭进程中RAS与ERS相互作用的分子机制仍有待于更深一步的研究。

综上所述，阿利吉仑通过阻断RAS，能够明显减轻急性肝衰竭进程中的肝脏炎症，减少肝细胞的凋亡，其保护作用可能与抑制内质网应激有关。因此，阻断RAS可能为急性肝衰竭的治疗提供新的思路。