外周血B淋巴细胞Notch在频繁复发/激素依赖肾病综合征患儿的作用研究

张 远 关凤军 于 跑 陈 娜 邱 闪 彭倩倩

儿童频繁复发/激素依赖肾病综合征(frequent relapse nephrotic syndrome/steroid-dependent nephrotic syndrome，FRNS/SDNS)临床上较为棘手，发生率较高[1]。目前FRNS/SDNS的标准治疗是在糖皮质激素(glucocorticoid, GC)基础上加用各种免疫抑制剂，或者反复加大GC剂量，但临床疗效仍不理想[2]。近年来研究报道应用利妥昔单抗(rituximab, RTX)治疗FRNS/SDNS可显著降低其复发率，该药的主要作用机制是通过结合B淋巴细胞表面的CD20抗原从而导致B淋巴细胞凋亡，或者通过抑制B淋巴细胞与T淋巴细胞之间的相互作用，从而可预防FRNS/SDNS的复发[1，3，4]。RTX有效治疗FRNS/SDNS的机制证实了B淋巴细胞数量增多以及异常活化参与了(primary nephrotic syndrome，PNS)的发病。基于此，进一步探讨FRNS/SDNS中与B淋巴细胞活化相关的因素，以期为优化RTX的治疗、进一步减少该疾病的复发提供理论依据。

资料与方法

1.一般资料：选择2018年10月～2019年7月于徐州医科大学附属医院诊断为初发PNS患儿70例，随访时间1年，所有患儿均给予诱导缓解及巩固维持治疗。根据其对GC的疗效及随访期间复发频次，排除不符合标准的PNS患儿，最终纳入本研究患儿58例，其中FRNS/SDNS组38例，其中男患儿21例，女患儿17例，患儿年龄1.3～14.2(6.7±3.4)岁；非频复发肾病综合征(non-frequent relapses nephrotic syndrome，NFRNS)组患儿20例，其中男患儿12例，女患儿8例，患儿年龄2.0～13.0(7.1±3.6)岁；另选取年龄、性别相匹配的健康体检儿童20例作为对照组，其中男性9例，女性11例，儿童年龄1.6～12.0(6.6±3.2)岁。诊断符合中华医学会发布的《儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治指南(2016年)》的标准[5]。各组性别、年龄等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理学委员会审批通过。

2.治疗方法与疗效判定：(1)治疗方法：所有患儿初次发病时均给予醋酸泼尼松片(江苏恒瑞制药有限公司,国药准字H41020636)2mg/(kg·d)分3次口服治疗，正规减量。完全缓解以血生化、尿检完全正常为标准。所有患儿均在完全缓解后l周复测各项指标。(2)疗效判定：PNS复发的诊断标准：连续3天，24h尿蛋白定量≥50mg/kg，或晨尿的尿蛋白/肌酐(mg/mg)≥2.0，或晨尿蛋白由阴性转为(+++)～(++++)。NFRNS：首次完全缓解后6个月内复发1次，或1年内复发1～3次。SDNS：对GC敏感(以泼尼松足量[2mg/(kg·d)或 60mg/(m2·d)]治疗≤4 周尿蛋白转阴者)，但连续2次减量或停药2周内复发者。FRNS：经GC标准疗程治疗后缓解，但病程中半年内复发≥2次，或1年内复发≥4次[5]。

3.主要试剂和仪器：藻青蛋白(allophycocyanin, APC)标记的抗人CD19抗体、异硫氰荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的抗人Notch1抗体、藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的抗人Notch2抗体(美国BD Biosciences公司)，人跨膜受体蛋白Notch1、Notch2、sCD23 ELISA试剂盒(上海江莱生物有限公司)。

4.方法：(1)流式细胞术检测CD19+B淋巴细胞绝对计数：测FRNS/SDNS组、NFRNS组GC初治前及治疗后和健康对照组清晨空腹1ml EDTA抗凝静脉血，首先测得总淋巴细胞绝对数；取100μl EDTA抗凝血，加入APC-CD19抗体，PBS洗涤，分析CD19+B淋巴细胞百分数，计算出B淋巴细胞绝对数。(2)CD19+B淋巴细胞Notch1、Notch2表达率测定：取两根流式管，分别标记为 B-1、B-2，B-1为同型对照组，B-2为待检测组；B-1管加入抗APC、FITC和PE标记的同型抗体，B-2管加入抗CD19(APC)、抗Notch1(FITC)和抗Notch2(PE)抗体；向B-1、B-2管中各加入混匀的50μl待测样品，室温避光孵育，37℃水浴，PBS洗涤1次，分析得出B淋巴细胞上Notch1、Notch2表达的相对数(百分数)。(3)ELISA法检测外周血清中Notch1、Notch2、sCD23的表达量：根据ELISA试剂盒操作步骤进行。(4)临床和研究室指标：收集各组患儿初次的发病年龄、性别、GC治疗前后尿蛋白定量(urine protein quantification，UCFP)、IgG等指标。

结 果

1.各组研究指标比较：GC治疗前，与健康对照组比较，FRNS/SDNS组、NFRNS组的UCFP、sCD23、CD19+B淋巴细胞绝对计数、Notch1表达明显升高，IgG降低，且FRNS/SDNS组较NFRNS组升高明显，差异有统计学意义(P<0.05)。GC治疗后，与健康对照组比较，FRNS/SDNS组和NFRNS组Notch1表达仍高于健康对照组，且FRNS/SDNS组仍高于NFRNS组，差异有统计学意义(P<0.05)。UCFP、sCD23、CD19+B淋巴细胞绝对计数、IgG、Notch2比较，差异无统计学意义(P>0.05)。FRNS/SDNS组和NFRNS组UCFP、sCD23、CD19+B淋巴细胞绝对计数、Notch1表达均较同组治疗前降低，IgG较治疗前升高，差异有统计学意义(P<0.05)，Notch2与治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1、图1。

表1 各组研究指标比较

图1 各组GC治疗前、后B淋巴细胞表面Notch1、Notch2的表达率A.健康对照组；B.FRNS/SDNS组治疗前；C.FRNS/SDNS组治疗后；D.NFRNS组治疗前；E.NFRNS组治疗后

2.FRNS/SDNS组GC治疗前B淋巴细胞上Notch1、Notch2表达率与UCFP、CD19+B淋巴细胞绝对计数、sCD23、IgG的相关性分析：FRNS/SDNS组GC治疗前Notch1表达率与B淋巴细胞绝对计数(r=0.756，P<0.001)、sCD23(r=0.421，P=0.009)呈正相关，与IgG(r=-0.537，P=0.001)呈负相关，与UCFP无相关性(r=-0.154，P=0.355)；Notch2与UCFP、B细胞绝对计数、sCD23、IgG均未显示相关性(r=-0.019，-0.147，-0.042，-0.185，P>0.05)，详见图2。

讨 论

PNS是儿童常见的肾小球疾病之一，近年来B细胞耗竭剂利妥昔单抗(RTX)治疗FRNS/SDNS取得一定疗效[3,4，6]。同时笔者前期研究及相关报道发现FRNS/SDNS患儿存在B淋巴细胞亚群分布异常，过渡和记忆B细胞可能存在清除或功能障碍，过渡B细胞可能是早期筛选FRNS/SDNS的生物学标志物[7,8]。Colucci等[9]通过检测FRNS/SDNS患儿RTX治疗后外周血B淋巴细胞亚群变化，发现记忆B细胞区室的恢复可作为预测复发的指标。因此B细胞的数量、表型和功能异常在PNS特别是FRNS/SDNS的发生中可能具有重要作用。

Notch1可以促进B淋巴细胞的发育，体外促进B淋巴细胞活化及促进抗体分泌[10]。Bertrand等[11]研究发现，Notch1在B淋巴细胞发育的多个阶段均表达，且在外周B淋巴细胞中持续低表达，Notch2仅限于前B细胞区室内表达。Notch1在淋巴细胞的发育和分化过程中起着非常重要的作用，Notch1信号转导以抑制胸腺中B细胞发育为代价，促进T细胞的发育[12]。Santos等[13]证实Notch可促进B细胞分化为抗体分泌细胞。Arima等[14]通过小鼠模型证实了Notch1信号转导失调的B细胞通过白介素33(IL-33)依赖性方式放大调节性T细胞(Treg)和2型辅助型T细胞(Th2)相关细胞因子的产生，从而对T细胞产生免疫调节作用。CD23是表达于活化的B淋巴细胞等多种细胞表面的跨膜糖蛋白，易被酶解为可溶性CD23(sCD23)，sCD23具有调节IgE的合成、刺激T和B淋巴细胞增殖等功能[15]。

本研究发现，FRNS/SDNS患儿疾病活动期CD19+B细胞计数、sCD23表达升高显著，经GC治疗缓解后均降低，提示FRNS/SDNS存在B淋巴细胞的异常活化及扩增[16，17]。Kim等[18]通过小鼠模型发现，肾小球中激活的B细胞可通过分泌IL-4诱导蛋白尿的产生和足突消失；同时FRNS/SDNS患儿外周循环中记忆B细胞升高，其可通过分泌细胞因子调节免疫反应[7～9]。所以FRNS/SDNS患儿外周血中异常激活的B细胞可能通过抗体非依赖性方式发挥致病作用。Notch1主要在外周血CD4+T细胞中表达，而Notch2在B细胞边缘区表达高于其他B细胞群。本研究发现Notch1在PNS患儿中表达高于健康对照组，因此笔者认为Notch1参与了PNS的发病，并且FRNS/SDNS组较NFRNS组升高明显，且FRNS/SDNS组中Notch1与B细胞绝对计数、sCD23表达量呈正相关，Notch2在各时期未见明显变化，因此Notch1的表达变化可能预测疾病复发。Notch1可激活B细胞受体信号(BCR)或脂多糖(LPS)，使Notch1在B细胞中表达增加，同时进一步促进B细胞活化，所以Notch1可在外周促进B细胞活化和扩增[14]。另有研究证实利用敲除糖尿病肾病模型中Notch1的表达，可减轻足细胞损伤，使蛋白尿减少，并延缓肾小球硬化的程度，同时发现Notch1与TGF-β途径相互作用，参与足细胞凋亡等过程[19]。因此，笔者猜测FRNS/SDNS存在外周血B淋巴细胞上Notch1的异常高表达，促进了B细胞的活化，介导了本疾病的发生、发展。

免疫球蛋白的类别转化被认为是人体产生不同类别的抗体和发挥不同功能的基础，本研究发现FRNS/SDNS患儿存在低IgG血症，所以FRNS/SDNS患儿可能存在抑制性T细胞增高，导致使分泌IgM的B细胞向分泌IgG的B细胞发生功能障碍[20]。同时Notch1激活后可与相应受体特异性结合，使活化的B细胞发生抗体转化功能障碍，抑制IgG的生成，导致机体吞噬、抗体介导的免疫调理功能等降低，从而加重了患儿的感染复发概率。

综上所述，FRNS/SDNS患儿疾病活动期存在B淋巴细胞的异常扩增及活化，Notch1高表达可能介导该疾病的发生，Notch1高表达可作为预测疾病严重程度及预后的指标，这可能为FRNS/SDNS的治疗提供了新的治疗靶点。