新型磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91对人神经胶质瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响

李玉玉，毛 萍，赵正刚，李美蓉，赵夏楠，李芳红，周素瑾，赵子建

(广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006)

神经胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，具有侵袭性强、预后差等特点[1-2]。2018年流行病学统计，我国神经胶质瘤的年发病率为(5-8)个/10万，5年死亡率在所有肿瘤中位居第三，仅次于胰腺癌和肺癌[3]。尽管近几年在胶质瘤的诊断和治疗方面取得了很大的进步，但对于高级别胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的预后仍不理想，患者两年生存率仅为26%-33%[4]。因此，寻找新型高选择性的靶向治疗药物极为重要。

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)是PDE家族中重要成员，能够特异性水解环磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)。而脑肿瘤组织中的cAMP水平明显低于正常脑组织[5]。此外，研究表明[6-7]，PDE4抑制剂咯利普兰(rolipram)通过提高细胞内cAMP水平能抑制脑肿瘤的生长，但由于其恶心、呕吐等严重的副作用而限制了进一步的开发和应用[8-9]。寻找新的副作用小且有效的PDE4抑制剂对脑肿瘤的治疗和防治具有重要意义。

ZL-n-91是基于第二代PDE4抑制剂设计而成的新型选择性PDE4抑制剂，对PDE4的抑制作用高于咯利普兰，且对PDE4B和PDE4D的选择性是其他PDE家族成员的5 000倍[10]。因此，ZL-n-91具有针对性强，选择性高，副作用小，能有效减弱甚至避免呕吐等不良反应的优点[10]。已有研究表明ZL-n-91对前列腺癌具有一定治疗效果[11]。此外，ZL-n-91对阿尔茨海默病等脑损伤具有保护作用且可有效穿透血脑屏障[12]。因此，本研究利用新型PDE4抑制剂ZL-n-91，通过体内外研究探讨其对神经胶质瘤增殖的抑制作用，以期为临床治疗神经胶质瘤提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞与动物 人胶质瘤U87细胞购买于中国科学院上海细胞库。6周龄，♀，体质量(15-20)g的BALB/c-nu裸鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2019-0010。

1.1.2药物与试剂 ZL-n-91 由药明康德公司合成；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；DMSO购买于美国sigma aldrich；CCK-8(cell counting kit-8，批号：G909FA003)购自上海生物工程有限公司；碘化丙啶(PI，批号：9039585)、PE Annexin V/7-AAD(批号：9074586)试剂购自美国BD公司。B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl相关蛋白(Bax)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、Ki67抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.1.3仪器 AC2-4S1型二级生物安全柜(ESCO，新加坡)；CLM-170B-8-NF型二氧化碳培养箱(ESCO，新加坡)；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，中国)；流式细胞仪(DXP AthenaTM，美国)；ChemiDoc+XRS化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；Leica倒置显微镜(Leica德国)；CMAXPLUS+酶标仪(美国)；-80 ℃冰箱(美菱，中国)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人胶质瘤U87细胞用含10%胎牛血清DMEM 培养基，于37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件的培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，及时更换培养液，每2-3 d传代一次，取对数生长期的细胞，消化并吹打制成细胞悬液，按所需浓度接种使用。

1.2.2CCK-8 法检测细胞增殖活性 将生长良好的U87细胞制备成单细胞悬液接种于96 孔板(3×104个/孔，每孔100 μL)，置于培养箱培养。实验共分为9组：空白对照组，溶剂对照组和50、100、200、300、400、500、600、800 μmol·L-1的ZL-n-91组。将96孔板过夜培养待细胞贴壁后，更换加入相应浓度ZL-n-91药物的培养基；继续培养48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，避免产生气泡，避光孵育1-2 h，取出，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度(A值)并计算细胞增值抑制率，采用GraphPad Prism 7.0软件计算药物的IC50。

细胞增殖率/%=(A给药组-A空白组)/(A溶剂对照组-A空白组)×100%；

细胞抑制率/% =[1-细胞增殖率(%)]×100%

1.2.3PI单染法检测细胞周期 取对数生长期的U87细胞，用无血清的基础培养基重悬，以2×108个/L接种于6孔培养板，置于培养箱培养，饥饿处理24 h；更换含有血清培养基，加入ZL-n-91(溶剂对照组，150 μmol·L-1，200 μmol·L-1)处理24 h；胰酶消化、离心、收集细胞，PBS洗涤离心后，加入1 mL体积分数为0.75的预冷乙醇，置于-20 ℃固定24 h以上；洗涤离心，按试剂盒说明书加入500 μL PE染色，室温避光孵育15 min，流式细胞仪进行周期检测，用ModiFit LT 5.0软件进行细胞周期分析。

1.2.4PE Annexin V/7-AAD检测细胞凋亡 取对数生长期的U87细胞，以2×108个/L接种于6孔培养板；铺板24 h后，分别加入ZL-n-91(溶剂对照组，150、200、300 μmol·L-1)，将细胞继续培养48 h；消化离心收集细胞，用1×Binding buffer制备成1×109个/L的细胞悬液，分别加入5 μL 7-AAD和5 μL PE染色，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，1 h内进行流式细胞检测，用Flow Jo V10分析软件分析结果。

1.2.5Western blot检测细胞周期、凋亡相关蛋白表达 用150、200、300 μmol·L-1ZL-n-91分别处理U87细胞48 h，RIPA裂解液裂解细胞，12 000×g离心15 min，取上清，BCA法检测蛋白浓度。5×上样缓冲液稀释，煮沸10 min。取等量蛋白样品在质量分数10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加一抗β-actin(1 ∶5 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、CDK2(1 ∶1 000)、CDK4(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶1 000)，4 ℃过夜孵育。TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，ECL发光仪曝光。采用ImageJ软件分析目的条带的相对表达水平。

1.2.6Ki67免疫组织化学染色 取新鲜肿瘤组织经固定、脱水、包埋后制备成石蜡切片，将肿瘤组织切成4 mm切片，经60 ℃烤片1.5 h，放入二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水，在0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中微波修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物活性，用正常山羊血清室温封闭。Ki67抗体(1 ∶500)4 ℃孵育过夜，室温孵育二抗1 h，DAB显色，苏木精复染3 min、盐酸酒精分化数秒、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察拍照。

1.2.7动物建模及给药 小鼠在广东药科大学动物实验中心SPF实验室饲养，饲养室温24 ℃，相对湿度45%-55%，实验设计及实验操作由广东药科大学动物伦理委员会审查和批准，动物伦理编号SPF2017027。在进行实验前适应性喂养1周。

取对数生长期的U87细胞，用无血清DMEM培养基制备浓度为2.5×1010个/L的单细胞悬液接种于雌性裸鼠右侧腋下，每只裸鼠接种0.1 mL(含2.5×106个细胞)。待肿瘤体积达到100 mm3左右时，将荷瘤小鼠随机分组：溶剂对照组和5 mg·kg-1ZL-n-91药物组。每天进行灌胃治疗，每两天测量裸鼠体重、肿瘤体积，计算肿瘤体积(V=0.52×长径×宽径2)，绘制裸鼠体重和肿瘤体积增长曲线。当对照组小鼠肿瘤体积达到1 500 mm3时，实验周期结束，麻醉处死小鼠，剥瘤称质量，拍照。

研究中使用的ZL-n-91为5mg·kg-1由质量分数为40% 羟丙基-β-环糊精和6%聚乙二醇硬脂酸酯溶于生理盐水配制而成，给药方式为灌胃给药。

2 结果

2.1 ZL-n-91抑制U87细胞增殖CCK-8检测不同浓度ZL-n-91(50、100、200、300、400、500、600、800 μmol·L-1)处理神经胶质瘤U87细胞48 h后，显著抑制细胞增殖(P<0.01)，且随着ZL-n-91浓度的增加，其抑制增殖的作用进一步加强(Fig 1)。计算ZL-n-91对U87细胞的半数抑制浓度(IC50)为274.5 μmol·L-1。以上结果表明ZL-n-91对神经胶质瘤U87的增殖具有明显抑制作用。

2.2 ZL-n-91对U87细胞周期的影响PI单染检测结果显示，与对照组相比，150、200 μmol·L-1ZL-n-91处理U87细胞24 h，G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.01)，S期细胞比例显著下降(P<0.05，P<0.01)(Fig 2A,B)。Western blot结果显示，与溶剂对照组相比，ZL-n-91处理组细胞周期蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1的表达量下调(Fig 2C,D)。以上结果表明ZL-n-91将U87细胞阻滞在G0/G1期。

Fig 1 Effect of ZL-n-91 on viability of U87 cells

2.3 ZL-n-91对U87细胞凋亡的影响利用Annexin V-PE/7-AAD标记U87细胞进行流式细胞凋亡检测，结果显示，经150、200、300 μmol·L-1ZL-n-91处理后，U87细胞凋亡程度增加(Fig 3A)，细胞凋亡率分别是11.08%±3.38%、14.49%±0.46%(P<0.05)、44.12%±5.87%(P<0.01)(Fig 3B)，表明ZL-n-91能够效诱导神经胶质瘤细胞凋亡且呈现浓度依赖性。Western blot检测结果显示，与对照组相比，ZL-n-91药物处理组抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表达没有明显差异(Fig 3C)，但Bcl-2/Bax比值下降(Fig 3D;P<0.05)。以上结果表明ZL-n-91能够促进神经胶质瘤U87细胞的凋亡，可能通过Bcl-2/Bax途径诱导细胞凋亡。

Fig 2 Effects of ZL-n-91 on cell cycle distribution of U87 cells

2.4 ZL-n-91对U87裸鼠异种移植瘤生长的影响为了研究ZL-n-91的体内抗肿瘤作用，构建了U87裸鼠皮下移植瘤模型。当肿瘤体积达到100 mm3左右，随机分组开始给药治疗。从给药d 22起，与溶剂对照组相比，给药组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组(Fig 4A,P<0.05)。在治疗期结束，剥离肿瘤并称重，结果显示，给药组小鼠肿瘤重量明显小于对照组(Fig 4B,C;P<0.01)。在整个治疗期间，两组小鼠的体重差异无显著性(Fig 4D)。以上结果提示，ZL-n-91可以显著抑制神经胶质瘤U87细胞裸鼠移植瘤生长。

2.5 免疫组化检测Ki67表达情况Ki67是细胞增殖的标志物。免疫组化结果显示(Fig 5)，与溶剂对照组相比，给药组肿瘤组织的Ki67阳性率降低(P<0.01)，该结果进一步表明ZL-n-91能有效抑制胶质瘤的增殖。

Fig 3 Effects of ZL-n-91 on cell apoptosis of U87 cells

Fig 4 Effects of 5 mg·kg-1 ZL-n-91 on U87 subcutaneous transplanted tumor

Fig 5 Expression of Ki67 of tumor tissues

3 讨论

神经胶质瘤是常见的原发性恶性肿瘤，手术难以完全切除病灶[13]，而化疗药物治疗效果有限，且具有副作用大，易产生耐药性等缺点[14]。尽管近年来在神经胶质瘤治疗方面取得较大的进步，但仍缺乏特异性和有效的药物。本研究首次利用新型的PDE4抑制剂ZL-n-91治疗神经胶质瘤，通过体内外研究证实其对人神经胶质瘤具有抗肿瘤活性，有效抑制神经胶质瘤U87细胞增殖，将U87细胞阻滞在G0/G1期并诱导细胞凋亡。

PDE4亚型表达水平在神经胶质瘤中显著升高，表明PDE4对神经胶质瘤的生长具有正向调节作用[6]。由于新型PDE4抑制剂ZL-n-91具有对PDE4的更强的抑制作用、选择性高、副作用低以及可以通过血脑屏障等优势[10-12]，提示ZL-n-91对神经胶质瘤的治疗具有良好的应用前景。本研究发现，ZL-n-91有效的抑制了神经胶质瘤细胞的增殖，通过体内试验证明，每日灌胃5 mg·kg-1ZL-n-91药物有效抑制裸鼠皮下神经胶质瘤的生长，且对小鼠没有产生明显的毒副作用，该结果为ZL-n-91临床治疗神经胶质瘤提供了可能。

本研究发现ZL-n-91将神经胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期。细胞周期调控有多重基因蛋白参与调控，周期蛋白依赖性激酶(CDK)的表达及活性是调控细胞周期的核心。其中CDK2和CDK4主要作用于G1和S时期，具有启动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用。Cyclin D1通过结合并激活G1期特有的CDK4，使G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，从而推动细胞周期由G1进入S期[15]。本研究结果显示，ZL-n-91能够明显下调CDK2、CDK4、Cyclin D1蛋白的表达，这也是ZL-n-91将胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期的主要原因之一。

本研究还发现ZL-n-91能够呈剂量依赖的促进神经胶质瘤细胞的凋亡。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中两种互为拮抗的凋亡蛋白，通过调控线粒体膜的通透性在细胞凋亡中发挥重要作用[16]。Bcl-2可与Bax形成二聚体，两者的比例失调是启动细胞凋亡的开关。当Bcl-2/Bax比值上调时，抑制细胞凋亡；反之，促进细胞凋亡[17]。本研究证实 ZL-n-91可以通过调控Bcl-2、Bax的表达，降低Bcl-2/Bax比值。因此，ZL-n-91可能通过Bcl-2/Bax途径诱导神经胶质瘤U87细胞的凋亡。

综上所述，新型PDE4抑制剂ZL-n-91能够显著抑制胶质瘤细胞增殖，阻滞周期进展，促进胶质瘤细胞凋亡，本研究为开发PDE4抑制剂作为抗神经胶质瘤的研究提供了一定的理论基础。