牡丹PsDHN1基因克隆及转基因拟南芥的耐涝性分析

刘慧春，张加强，马广莹，周江华，许雯婷，朱开元

（浙江省园林植物与花卉研究所，杭州 311251）

当植物遇到诸如涝害、干旱、低温等非生物胁迫时，会诱发体内产生一系列适应性反应[1-2]。为了适应或忍耐这些非生物胁迫，保护植物自身的细胞代谢，一些相关联的功能蛋白会被诱导表达[3]。脱水素蛋白（dehydrin,DHN）就是其中一种，它属于发育晚期丰富蛋白（late embryo-genesis abundant protein,LEA）第2家族成员，最早在受水分胁迫的水稻中被发现，后来发现该蛋白广泛存在于植物细胞中[4-5]。许多研究表明，在低温、高温、高盐、干旱等非生物胁迫下，植物脱水素蛋白基因的表达和积累与植物适应逆境胁迫的能力密切相关[6]。因此，DHN基因也引起了人们较多的关注。据报道，脱水素具有很强的热稳定性，在植物遭遇非生物胁迫时，该蛋白对维持植物细胞膜结构的稳定性起着至关重要的保护作用[7]。它的具体功能体现在清除细胞内的自由基、保护细胞的酶活性、稳定细胞膜、清除活性氧等[8]。国内外科研人员已在多个物种上开展了有关DHN 的研究，如小麦的脱水素基因TaDHN-1参与了小麦对干旱、高盐和低温等逆境胁迫的调节过程[9]；红树的脱水素基因AoDHN1受盐胁迫、干旱胁迫的诱导而表达[10]。不仅如此，通过过表达脱水素基因，还能提高植物抵抗非生物胁迫的能力，如过表达仙人掌脱水素基因OpsDHN1能够增强拟南芥的抗冻性[11]；沙冬青的AnDHN基因能改善拟南芥的抗盐性和抗旱性[12]；大麦的脱水素基因能有效改善拟南芥对甘露醇的渗透胁迫抗性等[13]。

牡丹（Paeonia suffruticosa）是我国的国花，肉质根，特别不耐水湿，从而限制了牡丹在江南地区的种植面积和品质。因此，如何提高牡丹的耐涝性以及培育出耐涝品种显得尤为重要。挖掘牡丹耐涝的关键基因，是开展牡丹分子育种的基础工作。迄今为止，尚未见牡丹脱水素基因克隆及其响应涝害胁迫方面的相关报道。在前期研究的基础上，本研究从牡丹叶片中获得了响应涝害胁迫的DHN1基因片段。基于此，采用cDNA 末端快速扩增（rapidamplification of cDNA ends, RACE）技术结合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术克隆获取该基因的全长cDNA 序列，对其生物信息学进行分析，并通过过表达拟南芥探讨牡丹DHN1基因的功能及其调控耐涝性的机制，为进一步开展牡丹耐涝分子育种做好准备工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型拟南芥由浙江农林大学农业与食品科学学院提供，牡丹叶片采自浙江省园林植物与花卉研究所牡丹资源圃。

1.2 研究方法

1.2.1 总RNA 提取

采用TR02-150 植物总RNA 纯化试剂盒（中国台湾GeneMark 生物科技有限公司）提取牡丹叶片的总RNA，并以获得的RNA为模板，使用反转录酶（Code No.2641Q）（日本TaKaRa公司）进行反转录，从而获得cDNA。

1.2.2PsDHN1基因的克隆

在前期获得的牡丹DHN1基因片段的基础上，采用引物设计软件Primer premier 6.0 设计5′RACE 引物5′RP-F/5′RP-R和3′RACE引物3′RP-F/3′RP-R（表1），并使用SMARTer®RACE 5′/3′试剂盒（美国Clontech公司），参照其说明书扩增获得PsDHN1基因的5′和3′末端序列。

将上述获得的5′和3′末端序列与前期获得的PsDHN1中间序列拼接起来并对其测序，最终获得牡丹PsDHN1基因的全长cDNA序列。以该序列为参考，分别设计上、下游引物GF 和GR（表1），以1.2.1 节获得的cDNA 为模板，获得牡丹PsDHN1的全长cDNA 序列，PCR 扩增程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，36个循环；72 ℃延伸5 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3PsDHN1基因的生物信息学分析

通过NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）上的开放阅读框（open reading frame,ORF）识别工具，获取PsDHN1基因的开放阅读框；利用在线工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对该基因氨基酸序列的理化指标进行分析；采用NetPhos 3.1 在线工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对该基因编码蛋白的磷酸化位点进行预测；采用NCBI网站中的Blastp程序对该基因的同源序列进行搜索，并对搜索到的同源序列进行多序列比对；采用软件CLC Genomics Workbench 11.0.1 进行蛋白质二级结构预测和聚类分析；采用在线软件I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER/）进行蛋白质的三级结构预测。

1.2.4PsDHN1基因的亚细胞定位

将获得的PsDHN1编码序列插入到35S启动子驱动的pCAMBIA1305-GFP载体中，构建重组载体35S::GFP-PsDHN1。通过根癌农杆菌转化法分别将重组载体和空载体35S::GFP转化到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片的表皮细胞中，最后在激光共聚焦显微镜下观察2 种载体的荧光显示结果。

1.2.5 转基因拟南芥的获得及培养

将克隆获得的牡丹PsDHN1基因开放阅读框与表达载体pSY06 通过同源重组系统进行融合。将基因构建物PsDHN1-pSY06 连接到UBQ10 启动子上，采用蘸花法将其转化入拟南芥，并在草铵膦上筛选转化子。根据一级转化子代中抗病或感病植株对草铵膦的分离比例，筛选出含有单一插入（PsDHN1全长编码区）的品系，从而获得纯合株系，并进一步获得纯合表达的转PsDHN1基因的拟南芥T2代株系。采用拟南芥播种基质[m（蛭石）∶m（珍珠岩）=2∶1]，分别播种T2代转基因拟南芥种子和试验材料野生型拟南芥种子于其上，在拟南芥生长室[昼夜温22 ℃/18 ℃，湿度75%，光照/黑暗12 h/12 h，光照强度400µmol/（m2·s）]培养10 d 后进行定植，转基因和野生型拟南芥各定植50株。

1.2.6 转基因拟南芥PsDHN1基因的实时荧光定量PCR

以1.2.2节获得的PsDHN1基因序列为参考，内参基因选择18S rRNA，采用在线工具Primer-Blast（http://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计荧光定量PCR引物。18S rRNA的引物序列如下：GTGA CGGGTGACAGAGAATTAG/CCGTGTCAGGATT GGGTATTT。PsDHN1的引物序列如下：CGGTGC GATGGTGTCATATT/CAAGGTGGGAGAAGGAAG AAAG。使用荧光定量PCR 仪（Mastercycler®ep realplex 4）（德国Eppendorf 公司）进行扩增，反应程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性3 s，60 ℃退火10 s，38 个循环；95 ℃变性15 s，65～95 ℃每增加0.5 ℃读取荧光1次，绘制熔解曲线。基因表达水平采用2－△△CT法进行计算，每个处理设置3个重复。

1.2.7 涝害处理

从培养40 d 后的拟南芥T2代转基因植株和野生型植株中，各选出30株大小一致的植株备用。将这60 株拟南芥连盆一起浸没在装有水的方形泡沫盒中，以淹没盆土表面1.5 cm 深度为宜。在0～5 d期间，每天上午选择同一时间进行取样，取样部位为莲座叶的第3 片叶，每个处理设置3 个生物学重复，经液氮速冻后放入－80 ℃冰箱保存，备用。其中20株植株（转基因和野生型各10株）在涝害处理结束后，再恢复生长1周，观察其恢复情况。

1.2.8 拟南芥酶活性测定

将样品从－80 ℃冰箱中取出，按照酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（上海市江莱生物科技有限公司）说明书进行粗酶液的提取和相关生理指标的测定，具体包括蔗糖合成酶（sucrose synthase, SS）、丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase, PDC）、α-淀粉酶（αamylase, RAMY）活性和可溶性蛋白（soluble protein,PRO）含量，每个样品重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 PsDHN1 基因的克隆结果

根据前期获得的牡丹DHN1基因片段，采用RACE 引物，以牡丹叶片的cDNA 为模板，进行RACE-PCR 扩增，获得了长度为864 bp 的牡丹PsDHN1全长序列。该序列包含1 个长471 bp 的开放阅读框、104 bp的5′非编码区和289 bp的3′非编码区；含1个信号肽，位于多聚A（poly A）尾的815～864 bp 处。分析可知，PsDHN1编码156 个氨基酸；结合在线工具ExPASy（http://www.expasy.org/）分析其结构域发现，PsDHN1全长序列含有2 个Y 片段、1个S片段和2个K片段（图1）。

2.2 PsDHN1 编码蛋白的理化性质分析

对PsDHN1基因编码的蛋白进行氨基酸含量和理化性质的预测分析，结果表明：该蛋白的分子质量为16.39 kDa，理论等电点为8.87，其氨基酸构成的数量及占比如表2所示。该蛋白带负电氨基酸残基数为14，带正电氨基酸残基数为16；脂肪族指数为34 042，亲水性指数为－1.274，推测PsDHN1 蛋白为亲水性蛋白；不稳定性指数为44.05，推测其为不稳定性蛋白。

2.3 PsDHN1 蛋白的二级结构预测

通过对PsDHN1 蛋白的二级结构进行预测，可知该蛋白含有3个α-螺旋和1个β-折叠。其氨基酸序列中的蛋白激酶C磷酸化位点和糖基化位点如图2 所示。统计发现，被预测的PsDHN1 蛋白质中含有8个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和2个络氨酸磷酸化位点（表3）。

图1 PsDHN1基因全长cDNA序列及其推测的氨基酸序列和结构域Fig.1 Full length sequence of cDNA and deduced amino acid sequences and protein domains of PsDHN1 gene

表2 PsDHN1蛋白的氨基酸组分Table 2 Amino acid components of PsDHN1 protein

图2 PsDHN1蛋白的二级结构预测Fig.2 Predicted secondary structure of PsDHN1 protein

2.4 PsDHN1 蛋白的三级结构预测

采用I-TASSER 软件，以315a 为模板，对牡丹PsDHN1蛋白的三级结构进行预测。从图3中可知，蓝色为预测蛋白的氮端，红色为预测蛋白的碳端。预测的PsDHN1蛋白结构的置信度（C）为－3.76，表明该蛋白的预测结构与模板3l5a 的同类结构相似度非常高；进一步分析可知，PsDHN1目标蛋白和模板蛋白315a的结构相似度为0.31±0.10。

表3 磷酸化位点预测结果Table 3 Predicted results of phosphorylation sites

图3 PsDHN1蛋白的三级结构预测Fig.3 Predicted tertiary structure of PsDHN1 protein

2.5 PsDHN1 蛋白的多序列比对及同源性分析

通过对牡丹PsDHN1基因与胡桃、苦瓜、麻风树等9个物种DHN1基因编码的氨基酸序列进行多序列比对发现，PsDHN1基因编码的蛋白具有高度保守性，含有典型的保守结构域Y 片段（对应于PsDHN1的第11—18、21—28个氨基酸）、S片段（对应于PsDHN1的第68—82个氨基酸）和K片段（对应于PsDHN1 的第88—102、140—154 个氨基酸）（图4），推测它们可能是牡丹脱水素蛋白的重要功能区。

由Blastp 比对结果发现，牡丹PsDHN1 蛋白与其他9 个物种存在着一定的相似性。其中，牡丹PsDHN1 蛋白与苦瓜（Momordica charantia）DHN1蛋白的相似度为58%，与麻风树（Jatropha curcas）和胡桃（Juglans regia）的相似度分别为54% 和53%。由此得出，PsDHN1 蛋白与这3 个物种的DHN1 蛋白同源性较高。将这10 个物种的DHN1蛋白进行聚类分析，结果发现，牡丹PsDHN1蛋白与胡桃（J. regia）、平榛（Corylus heterophylla）的聚为一类（图5）。

2.6 PsDHN1 的亚细胞定位分析

为了明确PsDHN1基因在细胞中的具体表达部位，对其进行了亚细胞定位分析。通过构建35S::GFP-PsDHN1融合表达载体，进而通过根癌农杆菌将其和空载体35S::GFP分别瞬时转化到本氏烟草叶片表皮细胞中。最后，通过激光共聚焦显微镜观察发现：不含目的基因的空载体在转化的烟草表皮细胞核、细胞质和细胞膜中都有表达；而含有目的基因的35S::GFP-PsDHN1融合载体主要在烟草表皮细胞核和细胞膜中表达（图6）。由此，我们推测牡丹脱水素基因PsDHN1主要定位于细胞核和细胞膜上。

2.7 转基因拟南芥的耐涝性分析

2.7.1 转基因拟南芥PsDHN1基因的定量表达分析

为了验证PsDHN1是否成功地转入拟南芥，我们对转化植株进行了该基因的定量表达分析（图7）。从T3代纯合的转基因拟南芥株系中随机选择3个株系（P1、P2 和P3），以野生型拟南芥（WT）为对照，分别进行实时定量PCR分析。结果显示：在3个转基因拟南芥株系中，PsDHN1基因的表达量是野生型拟南芥的12～50 倍，其中株系P2 的表达量最高（为WT的50倍），其次是株系P3（14倍）和P1（12倍）。由此说明，PsDHN1基因已成功转入拟南芥中。

图4 牡丹PsDHN1蛋白的多序列比对Fig.4 Multiple protein sequence alignment of PsDHN1 in P.suffruticosa

2.7.2 耐涝性表型分析

图5 PsDHN1蛋白与其他物种DHN1蛋白的聚类分析Fig.5 Clustering analysis of PsDHN1 protein and DHN1 proteins of other species

图6 PsDHN1在本氏烟草叶片中的亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of PsDHN1 in the leaves of N.benthamiana

图7 转基因拟南芥PsDHN1基因的实时荧光定量表达分析Fig.7 Real-time PCR expression analysis of PsDHN1 gene in transgenic Arabidopsis

对转PsDHN1基因的拟南芥植株及野生型植株进行涝害处理5 d后，观察其表型变化。结果发现，与WT 相比，转基因拟南芥植株的耐涝性要强于野生型植株。涝害处理5 d 后，野生型植株莲座叶的心部开始出现烂叶现象，而转基因植株除生长缓慢外，没有出现其他受害症状（图8A～B）。为进一步观察涝害处理后的植株恢复情况，将其从水槽中取出，正常培养7 d后观察其生长情况。结果发现，野生型拟南芥接近50%的植株叶片枯黄、萎蔫，无法恢复正常生长，而转基因拟南芥100%的植株都能恢复至正常生长状态，并开始抽薹、开花（图8B～D）。综上所述，牡丹PsDHN1基因转化拟南芥后，明显提高了拟南芥的耐涝性。

2.7.3 涝害相关的生理指标测定

图8 转基因拟南芥涝害处理的表型变化Fig.8 Phenotypic changes of transgenic Arabidopsis plants under waterlogging stress

如图9A 所示：转PsDHN1基因的拟南芥植株在涝害处理的0～5 d内，其体内的蔗糖合成酶（SS）活性呈现先上升后下降的趋势，在第4 天时蔗糖合成酶活性达到最大值（592.93 U/g）；第0 天时转基因植株的SS 活性最低（446.11 U/g）。野生型拟南芥植株（WT）SS 活性的变化趋势与转基因植株类似，但在涝害胁迫处理前后，其SS 活性均低于转基因植株；涝害处理4 d 时，其SS 活性达到最大值。涝害处理3 d 时，WT 与转基因植株之间的SS 活性差值最大，达93.94 U/g。如图9B所示：转基因拟南芥在涝害处理的0～4 d 内，其体内丙酮酸脱羧酶（PDC）活性呈现逐渐上升的趋势，在第0 天时其PDC 活性最低（0.072 9 U/g），到第4 天达到最高（0.114 9 U/g）。野生型拟南芥植株的PDC 活性变化趋势与转基因植株相似，在涝害胁迫处理前，其PDC活性高于转基因植株，但涝害处理后两者的差距逐渐缩小，到第2 天时显著低于转基因植株。如图9C 所示：转基因拟南芥植株体内的α-淀粉酶（RAMY）活性在涝害处理的0～3 d 内呈逐渐下降的趋势，第0 天时其RAMY 活性最高（0.36 U/g），到第3 天时活性降到最低（0.25 U/g）。野生型拟南芥植株的RAMY 活性变化趋势与转基因植株相似。涝害处理后，除第1 天外，转基因植株的RAMY 活性均高于野生型。如图9D所示：涝害处理期间，转基因和野生型拟南芥植株体内的可溶性蛋白含量均表现出持续下降的趋势。在涝害处理的0～2 d内，两者的PRO含量非常接近且均呈现缓慢下降的趋势；到第3 天，两者呈显著性差异，转基因植株中PRO 含量是野生型植株的1.4 倍。涝害处理后期（3～5 d），转基因植株的PRO 含量均明显高于野生型植株。

综上所述，转牡丹PsDHN1基因的拟南芥和野生型拟南芥在经过涝害处理后，其植株体内与涝害胁迫相关的酶如SS、PDC、RAMY 的活性和PRO 的含量均发生了较大的变化。在拟南芥植株上过表达牡丹PsDHN1基因，其SS和PDC活性得到明显提高。另外，与野生型植株相比，转基因植株体内与涝害胁迫相关的酶活性或含量总体上均高于野生型植株。

图9 涝害胁迫下转基因拟南芥的生理指标测定Fig.9 Physiological index measurement of transgenic Arabidopsis under waterlogging stress

3 讨论

植物在面临逆境胁迫时，其体内会合成一系列的逆境响应蛋白，以抵抗和适应环境胁迫的伤害[3]。脱水素蛋白是植物在非生物胁迫过程中被诱导表达的重要功能蛋白，在植物耐受逆境过程中发挥着重要的作用[14]。脱水素蛋白在模式植物拟南芥，农作物小麦、水稻、棉花、番茄，观赏植物仙人掌、杜鹃等多种高等植物上均有被发现[11,15-19]。该蛋白是一类重要的LEA蛋白，含有典型的Y片段和K片段保守结构域[6]。本研究从牡丹叶片中克隆获得了1 个脱水素基因PsDHN1，该基因编码的蛋白含有2个Y片段、1个S片段和2个K片段，是一个Y2SK2型脱水素，符合LEA 蛋白的典型特征，而且可能也是其发挥抗逆境胁迫作用的关键部分。前人的研究发现，脱水素中位于蛋白序列C 端的富含赖氨酸的K 片段，可以形成α-螺旋，该螺旋与其他蛋白的生物膜表面进行互作，从而在细胞脱水保护过程中发挥重要作用，以保护细胞结构。蛋白结构中出现的磷酸化现象，在脱水中也发挥着重要的作用[20-22]。本研究中对牡丹脱水素蛋白的二级结构预测结果显示，PsDHN1蛋白包含3个α-螺旋和1个β-折叠，8个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和2个络氨酸磷酸化位点。由此，我们推测PsDHN1蛋白的α-螺旋结构和磷酸化位点在牡丹的涝害胁迫过程中发挥着重要的作用。

大量研究表明，脱水素基因在干旱、高/低温、高盐碱等逆境胁迫的响应过程中扮演着重要的角色[7,23-25]。通过转基因手段将其转入植物，可以明显提高转基因植物的抗逆性。例如，在拟南芥中超量表达小麦脱水素基因DHN5，改善了拟南芥渗透胁迫抗性和抗盐性[26]；过表达杜鹃的脱水素基因RcDHN5提高了拟南芥的抗低温能力[19]；在烟草中过表达SbDHN1基因提高了植株对逆境胁迫的耐受能力等[27]。在诸多研究中，涉及最多的是脱水素基因对干旱胁迫的响应，而对于涝害胁迫，仅见报道的有芍药PIDHN1基因。该基因在响应低温、高温、涝害和脱落酸（ABA）等胁迫过程中，表现出不同的敏感性，其中对涝害的敏感程度最高，其次是高温、ABA 和低温[28]。然而，同样的基因在不同的物种上，其表现模式是否相同有待验证。为此，我们从牡丹中获得了脱水素基因PsDHN1，并对其进行了亚细胞定位分析。与芍药PIDHN1定位结果相似：芍药PIDHN1定位于细胞核和细胞膜上，而本研究获得的牡丹脱水素蛋白PsDHN1也主要定位于细胞核和细胞膜上。为进一步验证该基因的功能，本研究将其转化到拟南芥中，并对转基因植株进行涝害处理。通过分析表型变化发现，野生型拟南芥和转PsDHN1基因的拟南芥在经历持续5 d的涝害胁迫处理后，野生型植株受涝症状比转基因植株明显；再经过7 d的恢复生长，发现野生型植株比转基因植株恢复得差。所以，我们认为牡丹PsDHN1基因转入拟南芥后可以提高其耐涝性。据有关文献报道，植物在遭受涝害胁迫时，其根系处于低氧或无氧状态，会导致地上部分的碳水化合物大量消耗从而引起代谢紊乱。植物为了适应逆境、减轻自身受到的伤害，会启动与代谢相关的一些酶如SS、ADH、PDC 和RAMY 等来进行调节[29]。因此，本研究对转基因拟南芥中的这4 个主要酶活性或含量进行了测定。结果表明，转PsDHN1基因的拟南芥植株在涝害胁迫条件下，其体内的SS 和PDC 活性得到明显提高；与野生型植株相比，SS、PDC、RAMY 活性及PRO 含量都表现出转基因植株总体上高于野生型植株的现象，这与我们前期对牡丹响应涝害方面的研究结果存在一定的相似性[30]。由此说明，在拟南芥上过表达PsDHN1基因，促进了拟南芥体内与糖代谢相关酶发挥作用，减轻了植株的受涝程度。该研究结果进一步验证了牡丹脱水素基因PsDHN1可以提高植物的耐涝性，与前人报道的芍药脱水素PIDHN1的基因功能结果一致，推测其原因：一方面可能与该基因本身的结构、特性和功能有关，另一方面可能与牡丹和芍药为同科同属植物，亲缘关系非常近有关。当然，植物耐涝方面的功能基因很多，往往不是某一个基因在发挥作用，我们前期也挖掘了牡丹其他耐涝基因如PsGRP[30]。如果将这两者都转入拟南芥，是否会发挥更大的作用，以及PsDHN1基因在其他非生物胁迫下作用如何，都还有待后续开展进一步的研究。

4 结论

本研究采用RACE 技术从牡丹叶片中克隆获得了PsDHN1基因，该基因的cDNA 序列全长为864 bp，编码156 个氨基酸，属于典型的Y2SK2型脱水素，与胡桃的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明，PsDHN1主要定位于细胞核和细胞膜上。将该基因采用蘸花法转化拟南芥并进行耐涝性分析，结果表明，转PsDHN1基因的拟南芥植株的耐涝能力及恢复生长的情况均优于野生型植株，且涝害相关酶活性的动态变化也表明转基因拟南芥耐涝能力高于野生型植株。该研究结果为牡丹耐涝基因的挖掘和进一步研究牡丹耐涝的分子机制提供了理论依据，也为今后牡丹耐涝分子育种奠定了理论基础。