微生物和辐照对普洱生茶贮藏过程中品质转化的影响

田学凤，姚尧，汤一

（浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310058）

普洱茶是云南特有名茶，主要产于云南西双版纳、普洱、临沧等地区[1]。根据其品质特征和加工工艺的差异，普洱茶可分为普洱生茶与普洱熟茶2类[2]。其中，普洱生茶因其陈化生香的品质特点[3-4]与抗氧化、清除自由基[5-7]等功效，成为茶叶市场的一大消费热点。普洱生茶是由普洱原料茶（云南晒青毛茶）不进行渥堆工序、直接自然陈化而制成的，其新茶品质与绿茶较接近，茶性较为刺激。随着贮藏时间延长和茶叶陈化程度加深，茶性转为温和，口感更为醇和爽滑，滋味更为圆润甘甜[7-8]。因此，贮藏对于普洱茶品质的形成与转化具有重要意义。

现有研究发现，普洱原料茶中有大量的内生菌，且普洱熟茶渥堆过程中的微生物大多来自于茶叶内生菌、茶叶生长环境和茶叶加工车间[9]。在普洱茶中发现的微生物类群主要包括青霉属、曲霉属、酵母菌和细菌等[10]。然而，关于微生物对普洱茶品质的作用研究，大多着眼于普洱熟茶的渥堆过程[11-14]，有关普洱生茶在贮藏过程中发生品质转变的原因尚无定论，目前存在的主要说法有残余酶作用、微生物作用、化学氧化作用或它们之间的共同作用。本文旨在比较代表辐射化学氧化的辐照处理与代表生物氧化的微生物在普洱生茶陈化过程中的作用，试图解释陈化过程中普洱生茶的品质转化机制，为进一步优化普洱生茶贮藏条件提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试普洱生茶样品于2017 年4 月产自云南省临沧市镇康县，产品规格200 g/饼。

氢氧化钠（NaOH，≥99%）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、酒石酸甲钠（C4H4KNaO6）、硫酸亚铁（FeSO4）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1种没食子酸、8种儿茶素单体和3种生物碱单体的标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色谱纯级乙腈、甲醇、甲酸购自美国Tedia 公司；七水合硫酸亚铁、十二水合磷酸氢二钠、（D＋）-葡萄糖、二水合氯化亚锡购自国药集团化学试剂有限公司。

DL-WS210 型温湿度记录仪（杭州尽享科技公司）；BSA124S-CW型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒仪器有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（江苏省常州市国华电器有限公司）；HH-1J型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司）；SIGMA-3K15 型离心机（德国Sigma 公司）；HWS-250 型智能恒温恒湿培养箱（浙江省宁波市赛福实验仪器有限公司）；LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV-2802S 型紫外分光光度计（美国Unico 公司）；高能电子直线加速器（浙江省绍兴市华能电子加速器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验处理

开展3因素试验。

1）辐照剂量。0 kGy（未辐照）（A1）；5 kGy（A2）；9 kGy（A3）。采用高能电子直线加速器进行辐照，辐照时间30 s，电子线扫描宽度800～1 000 mm，－5.5%≤扫描不均度≤5.5%，－2.0%≤能量不稳定度≤2.0%，－2.0%≤束流强度不稳定度≤2.0%。

2）贮藏环境。在浙江大学茶叶研究所茶叶审评实验室内室温贮藏（B1）；在70%相对湿度＋30 ℃恒温恒湿培养箱内贮藏（B2）。

3）染菌处理。样品用铝箔袋密封包装后经不同辐照剂量灭菌，不拆封贮存，保持与外界空气隔离的无菌状态（C1）；经不同辐照剂量灭菌后拆封，裸露茶样于空气中26 h，染菌后再重新密封（C2）。

将上述3 因素试验进行组合，共有A1B1、A1B2、A2B1C1、A2B1C2、A2B2C1、A2B2C2、A3B1C1、A3B1C2、A3B2C1、A3B2C2等10 个处理，各处理茶样均分为6份，每份100 g，用统一的铝箔袋包装。在分别贮藏0、30、75、120、165、200 d后取样并进行成分检测。

1.2.2 微生物检测方法

1）样品前处理。准确称取茶样0.5 g，放入装有9.5 mL无菌水的三角瓶中，放置摇床上振荡2 h后，取出，静置20 min，重复1次平行试验。用微量移液枪吸取预处理的上清液1 mL，加无菌水，按10－1、10－2、10－3进行梯度稀释。

2）微生物的计数。分别取普洱生茶样品10－1、10－2、10－3稀释匀液各50 μL，加入到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和麦氏琼脂培养基上进行涂布，分别于适宜温度的培养箱中培养至菌落长出，然后选择涂布平板上单菌落数量适中的平板进行计数。通过形态学特征及显微观察对所分离的菌种进行鉴定。各培养基的目标培养物及培养条件如表1所示。

表1 培养基的用途及培养条件Table 1 Usage and culture conditions of mediums

3）微生物的形态观察[14-15]。细菌观察：革兰氏染色法。霉菌观察：在干净的载玻片中部滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液，挑取霉菌单个菌落，挑散于染色液中，盖上盖玻片，于40×10倍显微镜下观察其形态。

1.2.3 待测样品的制备

采用FW100 型高速万能粉碎机粉碎样品，过0.45 mm筛后，准确称取0.15 g（每个样品3次重复），置于50 mL离心管内，加入25 mL 50%乙醇后拧紧离心管盖，置于70 ℃水浴锅内恒温加热30 min（每10 min摇动一次），取出后冷却至室温，在4 ℃、1.2×104r/min条件下离心15 min，取上清液作为待测样品。

1.2.4 主要化学品质指标测定

含水量的测定采用120 ℃快速法（GB/T 8304—2013）；茶多酚含量的测定采用酒石酸亚铁法（GB/T 8313—2002）；游离氨基酸总量的测定采用茚三酮比色法（GB/T 8314—2013）；水浸出物含量的测定采用全量法（GB/T 8305—2013）；没食子酸、儿茶素组分含量的测定采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）。其中，没食子酸、儿茶素组分的HPLC 检测分析条件如下：Agilent TCC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A 采用3%乙腈＋0.5%乙酸＋96.5%超纯水，流动相B 采用30%乙腈＋0.5%乙酸＋69.5%超纯水；进样量10 μL，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm。洗脱梯度：0～40 min内B相以线性增长方式由20%增加至75%，40.01 min 时下降至20%的B 相后，以20%的B相保持5 min。

1.2.5 茶叶感官审评方法

为了防止茶样变质，储存到各时间节点的茶样先放置在－20 ℃冰箱中保存，等所有处理茶样完成储藏试验后再统一进行审评。依据GB/T 23776—2018，对茶样的外形、汤色、香气、滋味、叶底5 项因子分别进行评定，按外形20%、汤色15%、香气25%、滋味30%、叶底10%计算品质总分。

1.2.6 数据处理与分析

各处理均设3次重复，试验数据采用SPSS 21.0软件中的最小显著差异法、邓肯法及独立样本t检验法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中微生物数量变化

如表2所示，不同种群微生物相比，细菌总数明显多于霉菌，且被检出的霉菌菌落数比较少，酵母菌没有被检测到。辐照灭菌后未拆封的C1处理组，在贮藏的各个阶段均未有微生物被检出。总体而言，染菌茶样的微生物数量较少且未在贮藏过程中快速增长。一方面可能是因为茶样自带的初始微生物种类和数量较少，另一方面可能是因为茶饼基质含水量过低。如图1 所示，茶饼含水量在整个贮藏期间波动范围在7.0%～9.0%之间，且总体趋势随着贮藏时间的延长而降低，不能为微生物生长提供必要的水分。

2.2 主要品质化学成分含量变化

由图2 可知，贮藏过程中茶样的水浸出物含量总体上呈波动上升趋势，不同处理之间水浸出物变化幅度较为接近。

由图3 可以看出，贮藏期间游离氨基酸总量总体呈下降趋势，且不同处理之间氨基酸含量变化幅度较为接近。其中，9 kGy 辐照染菌处理茶样存放在室温和30 ℃条件下氨基酸减少较多，贮藏200 d时降幅分别为40.37%和38.82%。

表2 贮藏过程中微生物数量变化Table 2 Changes in the number of microorganisms during storage102CFU/g

图1 贮藏过程中各处理茶样含水量变化Fig.1 Changes in water content of tea samples in each treatment during storage

图2 贮藏过程中各处理茶样水浸出物含量变化Fig.2 Changes in aqueous extract content of tea samples in each treatment during storage

图3 贮藏过程中各处理茶样游离氨基酸总量变化Fig.3 Changes in free amino acid content of tea samples in each treatment during storage

由图4可知，随着贮藏时间的延长，茶多酚不可避免地发生了氧化，其含量呈波动下降趋势，且各处理的变化趋势较为一致。相对而言，经9 kGy 较强辐照处理后再染菌茶样的下降幅度更大一些，存放在室温和30 ℃条件下200 d 后，茶多酚含量降幅分别为37.65%和36.73%。

由表3 可知，儿茶素总量随着贮藏时间的延长呈下降趋势；尤以酯型儿茶素含量下降趋势更为明显。

由图5可知，经200 d贮藏后，茶多酚、游离氧基酸等主要内含成分含量均有所下降，只有水浸出物含量不降反升。

2.3 感官品质评价

图4 贮藏过程中各处理茶样茶多酚含量变化Fig.4 Changes in tea polyphenol content of tea samples in each treatment during storage

表3 普洱生茶儿茶素含量变化Table 3 Changes in catechin content of raw Pu’er teamg/g

总体上，随着贮藏时间的延长，各处理茶样品质得到明显改善，香气更加纯正、浓厚，茶汤涩味减少，滋味更加浓醇（表4～6）。由表5可知，A2B2C1感官品质最佳，得分相对较高，而A2B2C2茶样品质与未辐照的对照相比虽有改善，但总体品质不如同等剂量辐照下的无菌处理。由表6 可知，在9 kGy 辐照处理下，无菌处理组A3B1C1的总体品质优于染菌处理组A3B1C2。比较表5和表6发现：辐照可以改善普洱生茶品质，但并非辐照剂量越大越好，总体而言，5 kGy 无菌处理茶样的品质高于9 kGy 无菌处理，更高于未辐照处理，与周树红等对普洱熟茶贮藏试验的研究结果[1]较为相似；对于贮藏环境，贮存在30 ℃恒温条件下品质改善效果总体上明显优于室温贮藏。

图5 贮藏200 d后各处理茶样主要内含成分变化幅度Fig.5 Variation range of main inclusion components of tea samples in each treatment stored for 200 d

表4 未辐照普洱生茶贮藏200 d后感官品质评价结果Table 4 Sensory quality evaluation of unirradiated raw Pu’er tea stored for 200 d

表5 辐照5 kGy普洱生茶贮藏200 d后感官品质评价结果Table 5 Sensory quality evaluation of irradiated 5 kGy raw Pu’er tea stored for 200 d

综上所述，在本文贮藏条件下茶饼上附着的微生物对其品质转化不呈现正向促进作用，而辐照所带来的化学氧化效应对普洱生茶贮藏过程中的品质转化具有较明显的效果。

3 讨论

在本文试验条件，未辐照灭菌和辐照后染菌处理的茶样含有的微生物种类及数量较少，主要为霉菌和细菌（细菌含量相对较高），没有检测到酵母菌；且微生物数量变化没有明显规律。感官审评结果表明：在不同环境条件下贮藏的染菌处理的普洱生茶，在贮藏前期有苦涩味，而无菌处理的滋味相对浓醇甘爽；贮藏后期染菌处理的茶样品质有所改善，且优于未经辐照处理的，但其陈化品质仍不如同等条件下的无菌处理，说明在本试验条件下（温湿度不高、茶饼含水率在10%以内，类似干仓贮藏环境），少量微生物的存在对普洱生茶品质没有直接促进作用，而辐照所引起的化学氧化对陈化品质的形成具有较明显的作用，由此得出“化学氧化为普洱生茶陈化品质形成的主要因素，而微生物和茶叶中残余酶活性主导的氧化为次要因素”这一结论，但是对于微生物对普洱生茶的陈化是否有效以及相关的机制，仍需更多试验数据加以分析和验证。

表6 辐照9 kGy普洱生茶贮藏200 d后感官品质评价结果Table 6 Sensory quality evaluation of irradiated 9 kGy raw Pu’er tea stored for 200 d

在贮藏过程中茶样内含物质变化较为复杂，总体而言，水浸出物含量有一定幅度上升，而氨基酸、茶多酚和儿茶素含量均有一定幅度的下降，这与普洱生茶随着贮藏时间延长其滋味变得较为醇厚、苦涩味逐渐减轻的基本变化趋势较为吻合。

综合本文的研究结果进一步推测，微生物对普洱生茶与熟茶的品质转化具有不一样的作用。对熟茶而言，渥堆过程会滋生大量微生物，堆温是渥堆过程中的主要控制因子，最低温度不能低于40 ℃，最高温度不能高于65 ℃，生产中的堆温高低主要通过翻堆来调控[16]。根据长期的生产实践和相关的检测结果，一般认为，渥堆过程不会导致茶叶产生毒素，毒理学研究结果对普洱熟茶的安全性持肯定态度，人体的急性毒性试验表明，在10 g/d时未发现血液和生理学变化，长期毒性试验也未发现变化[17-20]。推测因渥堆过程中相对较高的温度和茶叶中的茶多酚对微生物生长具有抑制作用，故渥堆时茶叶中一般不会出现有害菌的生长繁殖。但对生茶而言，因为一般采用常温贮藏方式，缺乏高温条件的制约，一旦茶饼含水率过高，可能为各种杂菌的生长繁殖创造条件，不仅容易产生湿仓味，造成风味劣变[21]，而且其饮用安全性也会受到影响。所以，国家标准规定普洱生茶的含水量应在13%以内，以避免茶饼中微生物的生长繁殖。

致谢本文的微生物试验得到了浙江大学食用菌研究所陈再鸣副教授的大力帮助，谨致谢意！