冰冻切片免疫组化脱片的研究

浙江大学医学院附属第一医院（310003）彭会贞

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度后进行切片的方法[1]。术中冰冻病理检查可确定肿瘤性质，确定淋巴结是否有转移等，由于术中冰冻技术的局限性，以及某些肿瘤细胞HE染色形态上的相似性，导致单靠术中冰冻组织HE染色明确诊断困难较大，易漏诊误诊，造成患者的二次手术或医疗事故等[2]。免疫组化染色主要用于对不同组织来源肿瘤的鉴别诊断，快速免疫组化应用于术中冰冻，弥补了冰冻病理检查的不足。但是冰冻切片免疫组化技术还不是很成熟，实验流程一直在优化，由于冰冻组织是新鲜的，在快速免疫组化的实验步骤中，冰冻切片很容易脱片，作者经过反复的实验，摸索出冰冻切片免疫组化不脱片的条件，实验的流程如下。

1 材料

标本来自于浙江大学医学院附属第一医院病理科的术中冰冻标本，标本类型是肺、甲状腺、肾、阑尾等；一抗是细胞角蛋白CK，克隆号是AE1/AE3，购自中杉金桥；二抗是酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，购自中衫金桥；阻断剂是H2O2和甲醇1∶1的混合物；DAB购自leica公司；Buffer缓冲液购自Roche公司；载玻片选用石蜡切片免疫组化专用的TOMO（IHC Adhesive Glass Slide）载玻片。

2 方法

2.1 冰冻切片的制作 随机选取术中送检的新鲜组织三块并标记为A、B、C，A是肺组织，B是肺组织，C是甲状腺，对三块组织取完材，用纱布或滤纸吸干表面的液体，将要切取的平面朝下放到冰冻托上面，用OCT包埋，在液氮表面停留约30秒，液氮速冻，然后每块组织切成厚5um的冰冻切片各2张，冰冻切片用TOMO载玻片贴附，贴片时手要稳，片子分别标记为A1、A2、B1、B2、C1、C2。

2.2 冰冻切片的处理 切完的6张片子分别采用不同的处理方法：①A1、B1、C1片切完迅速放入4%福尔马林固定液中，固定2min，然后放入全自动冰冻切片染色机进行HE染色，封片；②A2片切完迅速放入4%福尔马林固定液中，固定2min，然后纯水轻柔地冲洗，放入buffer缓冲液中备用；③B2片切完先干燥2min，然后放入4%福尔马林固定液中固定2min，纯水轻柔地冲洗，放入buffer缓冲液中备用；④C2片切完迅速放入4%福尔马林固定液中，固定2min，然后空气干燥，完全干燥之后，纯水轻柔地冲洗，放入buffer缓冲液中备用。

2.3 快速免疫组化染色

2.3.1 内源性过氧化物酶阻断 取出切片A2，B2，C2，轻轻擦去多余的buffer缓冲液，然后置于湿盒中，滴加H2O2和甲醇1∶1的混合物室温放置2min，时间不能太长，太长可能会引起某些抗原的丢失。

2.3.2 孵育一抗 取出切片A2、B2、C2，放入buffer缓冲液中轻轻洗涤30s，轻轻擦去多余的buffer缓冲液，然后置于湿盒中，滴加一抗CK，盖上盖子，放入37℃恒温烤箱中，计时15min。

2.3.3 孵育二抗 取出切片，放入buffer缓冲液中轻轻洗涤30s，轻轻擦去多余的buffer缓冲液，然后置于湿盒中，滴加二抗，盖上盖子，放入37℃恒温烤箱中，计时5min。

2.3.4 滴加DAB 取出切片，放入buffer缓冲液中轻轻洗涤30s，轻轻擦去多余的buffer缓冲液，滴加新鲜配制的DAB液，显微镜下控制显色，显色完毕的切片放入纯水中洗涤。

2.3.5 苏木精复染，脱水封片 苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化，返蓝液返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯脱去乙醇，樱花全自动封片机封片。

3 结果

肉眼观察三块组织A、B、C的脱片情况，显微镜下观察细胞的皱缩情况，如附图1～3。

附图2 图5是B块组织的冰冻切片HE图片；图6是B块组织的冰冻切片免疫组化图片，两者组织大小用肉眼进行对比，组织没有脱片；图7是B块组织冰冻切片HE的细胞图；图8是B块组织冰冻切片免疫组化的细胞图，显微镜下观察，细胞均无皱缩。

附图3 图9是C块组织的冰冻切片HE图片；图10是C块组织的冰冻切片免疫组化图片，两者组织大小用肉眼进行对比，组织没有脱片；图11是C块组织冰冻切片HE的细胞图；图12是C块组织冰冻切片免疫组化的细胞图，显微镜下观察，细胞均无皱缩。

从上述图中的特征分析，在冰冻切片免疫组化的实验步骤中，切完片直接固定然后进行免疫组化染色的，很容易脱片；切完片先干燥2min然后再固定再进行免疫组化染色的，不脱片；切完片先固定再空气完全干燥切片的，不脱片；细胞都没有发生皱缩的情况；笔者又在其他的组织类型中，如阴茎、肾、阑尾等进行实验，得到同样的实验结果。

4 讨论

快速免疫组化运用于术中冰冻的主要技术要点有：①冰冻切片固定前干燥2min，能够保证组织不脱片，为什么选择2min？笔者也实验过干燥1min和3min，1min部分组织会脱片，3min组织未脱片，但是干燥时间越长细胞越容易皱缩，所以最后摸索出来的时间是2min；②冰冻切片固定完水洗后空气完全干燥，组织不脱片，笔者也尝试过组织空气干燥过程中，等组织半干燥就进行后续的染色，结果未完全干燥的组织很容易脱片，所以才选择空气完全干燥组织；③由于切片固定时间较短，不至于导致交联，所以行快速免疫组化前无需进行抗原修复，为临床手术争取时间；④一抗及二抗孵育后的清洗特别关键，充分清洗可减少非特异结合引起的背景染色，但是清洗时动作要轻柔，防止组织脱片。

常规的石蜡切片免疫组化技术已经很成熟，但是石蜡切片抗原丢失现象较常见，修复效果有些不理想，而冰冻切片其组织固定时间很短，基本无需微波和高压等热修复，制作过程与石蜡切片比较更为快捷、简便，因此更适合于抗原抗体的免疫组化检测[3][4]。术中冰冻切片结合快速免疫组化染色可大幅提高术中冰冻切片病理诊断正确性和效率[5]。