基于网络药理学探讨复方葛仲补骨汤治疗骨质疏松的作用机制

丛 鹤，韩 笑

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

近年来，随着网络药理学的发展，从整体角度研究药物的作用机制越来越被大众所接受，网络药理学主要是探究药物与疾病之间的关系，系统而综合分析药物对疾病的作用机制，进而阐释药物系统在人体的作用机制，其方法与中医的整体观和辨证论治思想相契合，进而成为研究药物作用机制的新方法[1].

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种是以骨量减少、骨组织微细结构被破坏而导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的系统性、全身性骨骼疾病[2].随着人口老龄化日趋严重，骨质疏松症已成为我国面临的重要公共健康问题.骨质疏松症的发病机制与机体骨重建的不平衡状态密切相关，骨重建是指旧骨的不断吸收与新骨的不断形成，从而达到机体的骨量平衡的过程，一旦该过程发生破坏，机体的骨量将会失衡，出现骨硬化或疏松的状态.当骨吸收大于其形成时，则有可能发生骨质疏松症.OP主要发生人群为中老年人及绝经期妇女，是继高血压、糖尿病的又一高发病.近年来，发病人群的年龄逐渐减小，所以，预防和治疗骨质疏松症成为大众关注的热点.

复方葛仲补骨汤由葛根、杜仲和黄精三味药材构成组方.组方中的葛根为豆科植物野葛的干燥根，早在《本草纲目》中就有记载：葛根性凉、气平、味甘，具有清热、降火、排毒的功效.葛根中含有的异黄酮类化合物与雌激素有着相似的化学结构，针对绝经妇女雌激素下降导致的骨质疏松症有明显的治疗作用[3].杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，是中国的名贵滋补药材，被《神农本草经》列为上品，其味甘、性温，主要功效为补益肝肾、强筋壮骨.杜仲可通过刺激成骨细胞增殖、抑制破骨细胞生长、增加骨密度、改善骨小梁微体结构等机制调节骨代谢并发挥抗骨质疏松作用[4].黄精为百合科黄精树的植物黄精、多花黄精或滇黄精的干燥根茎，其味甘、性平，有补脾益气、滋肾填精等功效.早在《日华子》有记载：“补五劳七伤，助筋骨，止饥”.黄精中的多糖成分通过调节骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)的表达活性而发挥治疗骨质疏松的作用，故选择应用复方葛仲补骨汤治疗骨质疏松症[5-6].本研究利用网络药理学方法，探讨复方葛仲补骨汤治疗骨质疏松症的作用机制，为复方葛仲补骨汤的药物研发奠定理论基础.

1 方 法

1.1 复方葛仲补骨汤活性成分的获取、筛选和靶点预测

通过TCMSP数据库(http：∥ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)获取葛根、杜仲和黄精的化学成分，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(druglikeness，DL)≥0.18为筛选原则，对获取到的成分进行筛选[7].借助TCMSP数据库和Pharmmapper数据库(http：∥lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)对获得的活性成分进行靶点预测.通过Uniprot数据库(http：∥www.uniprot.org/)得到靶点的标准基因信息.

1.2 构建药物-成分-靶点网络图

将收集的中药活性成分和靶点通过Cytoscape 3.6.1软件(http：∥www.cytoscape.org/)构建药物-成分-靶点网络[8].其中，节点代表药物、活性成分和靶点，边代表三者之间的关系，借助network analyzer工具进行网络特征分析，可更清晰地明确网络中重要的成分和靶点.

1.3 疾病基因的获取

以“osteoporosis”为关键词在OMIN数据库(http：∥www.omim.org/)、GeneCards数据库(http：∥www.genecards.org/)、Drugbank数据库(https：∥www.drugbank.ca/)和TTD数据库(https：∥db.idrblab.org/ttd/)搜索骨质疏松症的靶点，将4个数据库的靶点基因汇总并去除重复数据，将整理好的数据导入Uniprot数据库获取标准基因信息.

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)及关键靶点的筛选

将上述获得到的药物成分靶点基因和疾病基因借助韦恩在线作图软件(Venny 2.1.0 https：∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)制图，取交集，得到的交集基因借助String数据库(http：∥www.uniprot.org/)构建PPI网络.构建网络时，物种设置为“Homo sapiens”，并且隐藏无关联的靶标基因，然后借助Cytoscape3.6.1软件对该网络进行可视化处理[9]，应用CytoHubba工具以条件为“top 10”进行关键靶点的筛选.

1.5 GO功能富集分析

应用Metascape数据库(http：∥metascape.org/)导入交集基因，物种选择人类，选取个性化分析.利用GO功能富集分析对生物进程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular func-tion，MF)和细胞组分(Cell composition，CC)进行分析，并利用易汉博生物信息在线作图(http：∥www.ehbio.com/ImageGP/)软件制作气泡图.

1.6 KEGG通路富集分析

应用Metascape数据库(http：∥metascape.org/)导入交集基因，物种选择人类，通过个性化分析，将得到的KEGG通路富集分析结果利用易汉博生物信息在线作图(http：∥www.ehbio.com/ImageGP/)软件制作气泡图.

2 结 果

2.1 复方葛仲补骨汤活性成分及靶点预测结果

查询TCMSP数据库共获得4个葛根活性成分[10]，28个杜仲活性成分，12个黄精活性成分.见表1.其中，葛根、杜仲和黄精有1个共同活性成分，此外，葛根和黄精拥有1个共同活性成分.根据表2信息构建药物-成分-靶点的网络图.见图1.从图1中可以清晰地看到发挥主要作用的化学成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇和diosgenin等[11-13].

表1 复方葛仲补骨汤中活性化合物的基本信息Tab.1 Basic information of active compounds in Compound Gezhong Bugu Decoction

表1(续)

图1 药物-成分-靶点网络Fig.1 Drug-ingredients-target network

2.2 疾病基因的获取结果

将OMIN数据库、GeneCards数据库、Drugbank数据库和TDD数据库中与骨质疏松症有关的疾病基因进行统一整合，去除重复基因后获得该疾病基因共778个.

2.3 PPI网络图构建及关键靶点的筛选结果

2.3.1 PPI网络图构建

首先，应用韦恩在线作图软件对已经获取到的成分基因和疾病基因做取交集处理，获得交集基因共73个.见图2.应用String数据库构建PPI网络图，将交集基因输入数据库，物种选择人类.得到的网络图运用Cytoscape 3.6.1软件进行可视化处理，选用network analyzer工具对数据进行处理，节点从小到大，边由细到粗依次代表degree值越来越大，并在网络中作用越显著.结果见图3.

图2 药物-疾病基因韦恩图Fig.2 Drug-disease gene Venn

图3 PPI网络Fig.3 PPI network

2.3.2 主要靶点的筛选结果

在Cytoscape 3.6.1软件中应用CytoHubba工具以条件“top 10”对图3进行分析，获取到关键靶点分别为IL-6、VEGFA、ALB、TNF、PTGS2、MMP9、CXCL8、JUN、CCL2和IL-10.

2.4 GO功能富集分析结果

利用metascape软件对获取的73个交集基因做GO功能富集分析.分子功能包括17个条目：受体调节活性、核受体活性、转录因子结合、雌激素16-α-羟化酶活性、蛋白激酶结合、蛋白酶结合、核激素受体结合、丝氨酸型内肽酶活性、SMAD结合、氧化还原酶活性、作用于成对的供体上并带有或减少分子氧的核心启动子结合、整联蛋白结合、肿瘤坏死因子受体结合、酶激活剂活性、羧酸结合、铜离子结合和生长因子结合.见图4.

图4 复方葛仲补骨汤治疗OP的GO分子功能分析Fig.4 Analysis of GO molecular function of Compound Gezhong Bugu Decoction in treatment of OP

生物过程包括20个条目：介导致类固醇激素的反应、介导无机物的反应、介导脂多糖的反应、血管发育、介导细胞因子的信号通路、介导DNA结合转录因子活性的调节、介导类固醇代谢过程、活性氧代谢过程、腺体发育、多细胞生物过程、介导细胞外刺激的反应、对肽的应答、调节细胞黏附、肌肉细胞增殖、细胞分化的负调控、生殖结构发育、介导酮的反应、白细胞分化、细胞对生长因子刺激的反应和介导皮质类固醇的反应.见图5.

图5 复方葛仲补骨汤治疗OP的GO生物过程分析Fig.5 Analysis of GO biological processes of Compound Gezhong Bugu Decoction in treatment of OP

细胞组分包括11个条目：小窝(膜内陷)、细胞外基质、核转录因子复合体、血小板α颗粒管腔、内质网腔、核常染色质、血液微粒、溶泡、质膜的外侧、微绒毛和核体.见图6.

图6 复方葛仲补骨汤治疗OP的GO细胞组分分析Fig.6 Analysis of GO cell components of Compound Gezhong Bugu Decoction in treatment of OP

2.5 KEGG通路富集分析结果

利用metascape软件对获取的73个交集基因做KEGG通路富集分析，结果显示出20个条目：AGE-RAGE信号通路、癌症的信息通路、IL-17信号通路、疟疾、HTLV-I感染、FoxO信号通路、麻疹、HIF-1信号通路、癌症中的转录失调、类固醇激素的合成、同种异体移植排斥、TGF-β信号通路、p53信号通路、河马信号通路、白细胞跨内皮迁移、病毒性心肌炎、苯丙胺成瘾、胆汁分泌、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和PPAR信号通路.见图7.

图7 复方葛仲补骨汤治疗骨质疏松症的KEGG通路分析Fig.7 KEGG pathway analysis of Compound Gezhong Bugu Decoction in treatment of osteoporosis

3 讨 论

复方葛仲补骨汤治疗骨质疏松症是多种成分相互作用最后达到整体调节机体的目的，这种多种成分、大量靶点、多种通路的调节模式，在传统的研究模式中，无法清晰、有效、完整地揭示其中的作用机制，网络药理学可以很有效地解决上述问题.网络药理学是一门利用生物信息技术，可以从药物成分到靶点蛋白再到疾病基因构建出网络结构图，为分析多成分多靶点多通路的作用机制提供参考，其思想与中医的辨证论治的治疗方法和整体性不谋而合[14].

本研究在TCMSP数据库中获取得到葛根活性成分4个，杜仲活性成分28个，黄精活性成分12个，去除重复共有成分共计获得41个活性化合物成分.其活性成分主要有3′-甲氧基黄豆苷元、大豆苷元4，7-二葡萄糖苷等，其中，异黄酮类成分属于植物雌激素，可作用于下丘脑-垂体-性腺轴，降低骨代谢，上调下丘脑雌激素受体α和ERβ mRNA的表达，促进骨细胞增殖[15].活性成分中的多糖类可以显著逆转成骨细胞凋亡，从而改变骨微结构[16].这些成分对应的基因共有275个，在4个数据库中获取疾病的基因共798个，通过韦恩图得到二者交集基因共73个，通过Sting数据库的PPI网络构建，可以挑选到关键的靶点有IL-6、VEGFA、ALB、TNF、PTGS2、MMP9、CXCL8、JUN、CCL2和IL-10.这些基因参与雌激素16-α-羟化酶活性、蛋白激酶结合、蛋白酶结合、核激素受体结合、丝氨酸型内肽酶活性和SMAD结合等生物学进程而发挥抗骨质疏松的作用[17].同时，AGE-RAGE信号通路、癌症的途径、IL-17信号通路、疟疾、HTLV-I感染、FoxO信号通路、麻疹、HIF-1信号通路、癌症中的转录失调、类固醇激素的合成、同种异体移植排斥、TGF-β信号通路、p53信号通路、河马信号通路、白细胞跨内皮迁移、病毒性心肌炎、苯丙胺成瘾、胆汁分泌、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和PPAR信号通路整体作用于机体，从而达到治疗骨质疏松症的作用[18].

综上所述，复方葛仲补骨汤治疗骨质疏松症的机制是从多成分、多靶点、多通路出发，从整体角度出发，围绕运用网络药理学技术手段阐释药物-机体-疾病之间的相互作用的，为临床治疗骨质疏松症提供参考.