扁塑藤素对非小细胞肺癌增殖及线粒体膜电位的调节作用

吴 雷，王玲玲

(1.吉林市中心医院，吉林 吉林 132011；2.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

扁塑藤素(Pristimerin，PTM)是一种天然三萜系化合物[1]，PTM及其相关化合物具有抗感染、抗氧化以及不同程度的抑制肿瘤作用[2].相关肿瘤抑制机制包括细胞周期阻滞、蛋白酶体活性诱导细胞凋亡、线粒体功能障碍等[3]，但针对细胞线粒体膜电位的调节鲜有报道.本研究主要在体内外环境中分别探讨PTM对非小细胞肺癌的增殖和线粒体膜电位的调节作用，为明确PTM抑瘤机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 材 料

PTM提取物、A549及H226细胞株、0.9%生理盐水(北华大学附属医院精准医学中心)；RPMI 1640培养液、优质胎牛血清、胰酶(GIBCO公司，美国)；双抗、DMSO、甲醇、溴酚蓝混合液、0.5%结晶紫、MTT(北京百泰克生物技术有限公司)；细胞线粒体膜电位检测试剂盒(北京天根生物技术有限公司)；BALB/c裸鼠(吉林大学基础医学院免疫学教研室).

1.2 方 法

1)MTT方法测定PTM作用下A549及H226细胞株的细胞存活率.按细胞浓度为10×104/mL进行MTT实验备板，待细胞贴壁生长后进行后续研究.PTM按预设浓度(0、1、2、4、8、16 μmol/L)进行分组，分别与备板细胞共培养1.5、3、6、12 h，每组设立3个复孔.应用酶联免疫分析仪在490 nm波长处测定吸光度值，得3个复孔平均值，绘制细胞存活曲线图.

2)细胞集落形成实验检测PTM对非小细胞肺癌的长期毒性作用.选择状态良好的A549和H226单细胞悬液，按1×103个/孔细胞接种于6孔板中与PTM共培养.按PTM浓度分组：0 μmol/L组(对照组)、0.1 μmol/L组、0.2 μmol/L组，设2个复孔；待肉眼可见克隆时终止培养，干燥后应用甲醇固定，0.5%结晶紫染色，倒置显微镜下记录细胞集落数目.

3)PTM对A549移植瘤的生长抑制实验.选择30只BALB/c裸鼠(4周龄，20～22 g)，无菌饲养室12 h光照/黑暗循环，充足补给(食物和水)，环境适应期3 d.该研究经首都医科大学伦理委员会(中国北京)批准(编号2017091011号).取备用A549细胞单细胞混悬液(浓度为1×106/mL，0.9%生理盐水)100 μL接种于裸鼠前肢腋下位置，连续观察移植瘤1～2周，记录裸鼠体质量及肿瘤体积，直至肿瘤体积150 mm3左右视为造模成功.按PTM腹腔内注射剂量进行随机分组：0.9%生理盐水空白对照组(50 μL)、PTM 1 mg/kg治疗组(50 μL)、PTM 2 mg/kg治疗组(50 μL)，1次/2 d，连续治疗4次；维持10 d，裸鼠颈椎脱臼处死，留取移植瘤瘤体，并称质量.

4)应用流式细胞术测定PTM作用后细胞线粒体膜电位.PTM选择8 μmol/L，分别与对数生长的A549和H226细胞共培养0(control)、3、6 h，替换含有10 μg/mL的Rhodamine 123细胞培养液4 mL，置于培养箱中孵育30 min，收集贴壁细胞制备单细胞悬液.每组任选1×104个细胞进行检测，重复各组实验3次，记录平均值.

2 结 果

2.1 MTT法测定PTM作用下A549及H226细胞株的细胞存活率

应用MTT法测定PTM(0、1、2、4、8、16 μmol/L)作用下A549和H226细胞不同时长(1.5、3、6、12 h)的细胞存活率.与空白对照组比较，A549和H226两组细胞随PTM剂量的增加及孵育共培养时间的延长，细胞的平均存活率显著降低.以PTM与两组细胞孵育共培养6 h为基准，随着PTM浓度升高，细胞存活率下降为A549细胞组：93.2%、81.27%、69.12%、54.82%、32.11%；H226细胞组：91.15%、84.02%、72.56%、53.12%、31.15%.本研究结果表明：PTM对非小细胞肺癌细胞株(A549和H226)的细胞抑制作用存在剂量和时间的关联性.分别计算PTM孵育共培养6 h的IC50浓度值：A549细胞的IC50值为8.25 μmol/L，H226细胞的IC50值为8.17 μmol/L.见图1.

图1 PTM作用下A549及H226细胞株的细胞存活率Fig.1 Cell survival rate of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

2.2 细胞集落形成实验检测PTM对非小细胞肺癌的长期毒性作用

通过细胞集落形成实验检测PTM对两组非小细胞肺癌细胞(A549和H226)增殖的长期毒性作用.PTM与细胞共孵育浓度分别采用低浓度0.1、0.2 μmol/L，培养第6天进行细胞集落计数，研究结果显示：与对照组(0 μmol/L)比较，0.1 μmol/L组A549及H226的细胞集落形成均受到抑制，并且0.2 μmol/L 组的细胞集落形成抑制更为明显.研究结果表明：PTM对非小细胞肺癌细胞株(A549和H226)的长期细胞抑制作用同样存在剂量和时间的关联性.见图2.

图2 PTM作用下A549及H226细胞株的细胞集落Fig.2 Cell colony of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

2.3 PTM对A549移植瘤的生长抑制

分析PTM对A549移植瘤体积及瘤体湿重影响的结果显示：不同PTM腹腔内注射在治疗第4天开始即出现肿瘤体积抑制现象，第5天移植瘤体积与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01).在治疗第7天，PTM 2 mg/kg治疗组的移植瘤体积抑制作用优于PTM 1 mg/kg治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05).湿重对比分析结果显示：PTM 1 mg/kg治疗组及PTM 2 mg/kg治疗组湿重明显低于空白对照组(P<0.01).PTM 1 mg/kg治疗组与PTM 2 mg/kg治疗组进行组间比较，结果显示：PTM 2 mg/kg治疗组移植瘤湿重低于PTM 1 mg/kg治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05).初步证明不同浓度PTM对体内非小细胞肺癌增殖同样存在抑制作用.见图3.

图3 PTM对A549移植瘤的生长抑制Fig.3 Growth inhibition of PTM treatment on A549 transplanted tumors

2.4 流式细胞术测定细胞线粒体膜电位结果

应用流式细胞术测定两组经PTM 8 μmol/L共培养的非小细胞肺癌(A549和H226)细胞线粒体膜电位，结果显示：PTM对各组细胞作用时间持续3 h即可导致细胞线粒体膜电位下降，持续6 h时线粒体膜电位下降更为明显，提示细胞线粒体膜电位与PTM对非小细胞肺癌细胞作用时长呈负相关，并初步证明PTM具有诱导非小细胞肺癌细胞线粒体膜电位去极化作用.见表1、图4.

表1 PTM作用下A549及H226细胞株的线粒体膜电位Tab.1 Mitochondrial membrane potential of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

图4 PTM作用下A549及H226细胞株的线粒体膜电位Fig.4 Mitochondrial membrane potential of A549 and H226 cell lines with PTM treatment

3 讨 论

恶性肿瘤是正常细胞在致癌因素的作用下发生的异常增生，在结构、功能和代谢方面均与正常细胞或组织显示出明显的不同，其发生是多因素、多阶段、复杂渐进性的过程，具有细胞或组织的无限增殖且具有浸润性和转移性特点.流行病学调查[4]显示：每年全球新发肿瘤患者可达700多万人，预计在2030年肿瘤患者可能突破1 310万人/a，我国癌症死亡人数占全球癌症死亡总数的1/4以上，并且近年来恶性肿瘤的发病趋向年轻化.目前，针对恶性肿瘤治疗仍然集中在手术治疗、放射线治疗及化学药物治疗，其中化学治疗占治疗手段的主体地位，对于手术治疗或放射治疗方案仍保留部分化学治疗为辅助手段.但由于癌细胞的基因易变性，产生了耐药细胞逃逸、化疗药品对正常组织或细胞的强力杀伤等诸多问题，已经限制了大量化疗药物的临床应用.因此，从不同途径寻求新型抗癌药物及探寻新的抑瘤机制仍是攻坚恶性肿瘤的基石.

扁塑藤素作为一种天然抗肿瘤候选新品已经在多种瘤体中显示其广谱的抗肿瘤作用[5]，并且作为一种配伍药品也显示了瘤体高选择性、正常组织低毒性及对铂类药品增敏等优势[6-9].本研究以非小细胞肺癌细胞系A549及H226为体内外实验标本来源，应用PTM施加外源性刺激，研究结果发现：不同浓度PTM(0、1、2、4、8、16 μmol/L)作用于A549和H226细胞不同时长(1.5、3、6、12 h)，其细胞存活率随PTM剂量的增加及孵育共培养时间的延长显著降低，提示PTM对非小细胞肺癌细胞株(A549和H226)的细胞抑制作用存在剂量和时间依赖.计算PTM孵育共培养6 h的IC50浓度值：A549-IC50=8.25 μmol/L，H226-IC50=8.17 μmol/L，提示PTM对两种非小细胞肺癌细胞株作用接近，进一步证实了PTM的抑瘤广谱性.以PTM 0.1、0.2 μmol/L与非小细胞肺癌细胞株(A549和H226)共培养发现细胞集落单克隆形成同样受到抑制，并且存在剂量和时间的正反馈作用.经A549移植瘤模型的体内实验进行移植瘤体积及瘤体湿重对比分析也证实了PTM的抑瘤作用依然存在剂量和时间的依赖性，在一项关于扁蒴藤素体外对HL-60细胞作用的研究[7]中也得到了同样的结论.有报道[10]提示，PTM抑瘤机制可能包括细胞周期阻滞、蛋白酶体活性诱导细胞凋亡及线粒体功能障碍等.线粒体是细胞凋亡及其他死亡途径的核心环节，其膜的作用在于维持能量和细胞稳定.本研究中，应用流式细胞术测定细胞线粒体膜电位研究结果显示：PTM作用持续3 h即可导致细胞线粒体电位下降，持续6 h时线粒体膜电位下降更为明显，并初步证明PTM具有诱导非小细胞肺癌细胞线粒体膜电位去极化作用，这可能是PTM对非小细胞肺癌发挥抑制作用的机制之一.另外，还有关于PTM直接作用于线粒体膜电位诱导人乳腺癌发生caspase依赖性凋亡[11]、PTM通过活性氧介导的线粒体膜电位功能障碍发挥类热休克蛋白90(HSP90)抑制剂活性导致肿瘤细胞凋亡等研究[12]报道.上述研究结果均支持PTM对非小细胞肺癌具有抑制增殖作用，并且与浓度及作用时间存在正相关，其机制可能是启动了线粒体膜电位的去极化程序，为后续明确PTM的广谱抑瘤机制提供了参考.