胃癌细胞活性与细胞周期相关蛋白表达相关性分析

章其琦，费素娟

(徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221012)

胃癌是源自胃黏膜上皮细胞的消化系统恶性肿瘤，发病率和死亡率均居于全部恶性肿瘤的前列[1].随着近年来幽门螺旋杆菌检测和胃镜检查的应用，胃癌发病率有所下降，但仍是仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤[2].手术和化疗是目前临床治疗胃癌的主要手段，但手术适应证较为严格，部分患者确诊时已失去手术机会.由于化疗的副反应较为明显，部分患者因无法耐受副反应而停止治疗.上述原因最终导致胃癌患者预后不理想，复发率和死亡率均处于较高水平[3].随着对肿瘤研究的不断深入，研究者开始从基因水平探究肿瘤发生、发展的相关机制，也成为目前胃癌的研究热点之一[4].细胞周期相关蛋白(CAPRIN1)能够与细胞周期蛋白依赖性激酶特异性结合，调节其活性，介导细胞周期.相关研究[5-6]显示：CAPRIN1在肺癌、肝癌、结直肠癌等进展及耐药性产生中发挥重要作用.动物实验[7]结果显示：CAPRIN1高表达于胃黏膜组织中，下调其表达后能够有效降低小鼠B淋巴细胞的活性.本研究通过细胞转染技术在体外上调胃癌细胞SGC-7901中CAPRIN1的表达，探讨其对SGC-7901细胞增殖、迁移的影响.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人胃癌细胞SGC-7901(武汉普诺赛生命科技有限公司)；氨苄青霉素、链霉素、胎牛血清、RPMI-1640培养基(苏州艾莱萨生物科技有限公司)；pGEX-5X-3-CAPRIN1质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)；鼠抗人CAPRIN1单克隆抗体、兔抗人p-Akt、CyclinD1单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG(维森特生物技术(中国)有限公司)；Trizol试剂、CCK-8试剂、DAB试剂、Transwell小室(维森特生物技术(南京)有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 SGC-7901细胞培养与分组

将冻存的SGC-7901细胞从-80 ℃冰箱中取出，转入37 ℃恒温水箱中融化，3 000 r/min离心10 min，移入超净工作台，除去上层培养液，加入含10%胎牛血清、链霉素、氨苄青霉素的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2孵育，胰蛋白酶消化并传代.将SGC-7901细胞分为空白对照组(常规培养)、阴性对照组(转染pGEX-5X-3空载体质粒)、研究组(转染pGEX-5X-3-CAPRIN1质粒)，荧光显微镜下观察细胞形态和转染情况.

1.2.2 SGC-7901细胞增殖能力检测

取各组SGC-7901细胞，密度调整至1×104/mL，按1×104/孔将细胞加入96孔板中，每组设5个复孔.上述细胞分别孵育12、24、48、72、96 h，培养条件为37 ℃、5% CO2，在各时间点向对应孔中加入CCK-8试剂10 μL，使用迈瑞MR-96A多功能酶标仪读取490 nm处的吸光度值.

1.2.3 Transwell细胞迁移实验

SGC-7901细胞用含胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬，按1×104SGC-7901细胞加到Transwell小室中，孔径为8 μm，下层增加含胎牛血清的RPMI-1640培养，取对数生长期SGC-7901细胞，胰蛋白酶消化、10%胎牛血清重悬细胞并计数，37 ℃、5% CO2培养12 h，擦除Transwell细胞小室中残存的细胞，应用磷酸缓冲液冲洗后再用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色，光学显微镜拍照并计数.上述操作重复5次.

1.2.4 RT-PCR检测CAPRIN1 mRNA表达水平

向SGC-7901细胞中加入Trizol试剂，提取总RNA，使用反转录试剂盒获得cDNA.CAPRIN1、β-actin引物序列由北京蓝博斯特生物技术有限公司设计合成.CAPRIN1上游引物5′-GAAAGCTTGTTAAT TGGCGGAT-3′，下游引物5′-TGTTAGGAAACACCG AAGCTTA-3′；内参β-actin上游引物5′-ATAAAA GTCCACGGCTACCG-3′，下游引物5′-CTTAGTTTT TCTCCGTCACCC-3′.反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 30 s，共35个循环，延伸72 ℃ 1 min.扩增产物电泳后计算CAPRIN1 mRNA的相对表达量.

1.2.5 Western blot法检测CAPRIN1、p-Akt、CyclinD1蛋白水平

分别取空白对照组、阴性对照组、研究组SGC-7901细胞1×104个，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量.采集目标蛋白，电泳后转膜至PVDF，常温下封闭1 h，滴加鼠抗人CAPRIN1多克隆抗体(1∶500)、兔抗人p-Akt单克隆抗体(1∶200)、兔抗人CyclinD单克隆抗体(1∶500)，4 ℃静置过夜，滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG，1∶1 000稀释，静置2 h，ECL显色，黑暗环境下显影，检测各条带灰度值.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 荧光显微镜下鉴定质粒稳定转染的SGC-7901细胞株

SGC-7901细胞转染48 h后，荧光显微镜下观察阴性对照组和研究组的细胞质中是否存在绿色荧光.空白对照组中无荧光，说明本实验已成功构建了pGEX-5X-3-CAPRIN1空载体质粒、pGEX-5X-3-CAPRIN1质粒转染的SGC-7901细胞株.见图1.

图1 荧光显微镜下鉴定质粒稳定转染的SGC-7901细胞株(×100) Fig.1 Identification of SGC-7901 cell line stably transfected with plasmid by fluorescence microscope (×100)

2.2 各组SGC-7901细胞CAPRIN1 mRNA和蛋白表达情况

转染48 h后，与阴性对照组和空白对照组比较，研究组SGC-7901细胞CAPRIN1mRNA和蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；SGC-7901细胞CAPRIN1mRNA和蛋白表达水平在空白对照组与阴性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 各组SGC-7901细胞CAPRIN1 mRNA和蛋白相对表达量Tab.1 CAPRIN1 mRNA and protein expression in SGC-7901 cells of each group

2.3 各组SGC-7901细胞增殖水平

培养96 h内SGC-7901细胞增殖水平呈上升趋势，在培养48、72、96 h时，与阴性对照组和空白对照组比较，研究组SGC-7901细胞增殖水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05).见表2.

表2 不同时间点各组SGC-7901细胞增殖情况Tab.2 SGC-7901 cell proliferation in different time points

2.4 各组SGC-7901细胞迁移能力

研究组的迁移SGC-7901细胞数明显多于阴性对照组、空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；迁移SGC-7901细胞数在空白对照组与阴性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表3、图2.

图2 Transwell细胞迁移实验检测SGC-7901细胞迁移能力(×100)Fig.2 Transwell cell migration assay was used to detect the migration ability of SGC-7901 cells(×100)

表3 各组SGC-7901细胞迁移数 Tab.3 Migration number of SGC-7901 cells in each group

2.5 各组SGC-7901细胞p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平

与阴性对照组和空白对照组比较，研究组SGC-7901细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01).p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平在空白对照组与阴性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表4、图3.

表4 各组SGC-7901细胞p-Akt、CyclinD1蛋白表达水平Tab.4 Expression of p-Akt and CyclinD1 in SGC-7901 cells of each group

1.空白对照组；2.阴性对照组；3.研究组.图3 各组SGC-7901细胞Akt磷酸化及CyclinD1蛋白表达水平Fig.3 Akt phosphorylation and CyclinD1 protein expression in SGC-7901 cells of each group

3 讨 论

胃癌细胞高度增殖、迁移能力是患者不良预后和死亡的主要原因.目前，胃癌增殖和转移过程中的分子调控机制仍未明确，探讨相关分子调控机制对胃癌的诊治具有重要意义，也是近年来肿瘤靶向治疗和免疫治疗的理论基础[10].研究[11]发现：在胃癌、结直肠癌等消化系统恶性肿瘤发生、发展过程中，原癌基因、抑癌基因、miRNA基因发挥重要的调控作用.相关研究[12]显示：HYALI、TRKA、KLF等基因转录后能够参与调控肿瘤细胞的增殖、分化、转移、侵袭，参与恶性肿瘤的病情进展.基础研究[13-14]结果显示：CAPRIN1作为基因转录后的调控因子，能够促进大鼠体内肿瘤的生长、迁移和侵袭，明显缩短大鼠的生存时间；CAPRIN1在与RNA结合蛋白特异性结合后能够影响靶基因活性，合成并分泌应激颗粒，增强恶性肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，可推测CAPRIN1表达水平与人胃癌组织的恶性程度呈正相关.近年来研究[15]发现：乳腺癌、肺癌细胞中miR-24、miR-206等的CAPRIN1特异性miRNA表达下降，提示CAPRIN1基因的表达水平可影响患者病情的进展.体外细胞学实验和体内动物学研究[16-17]均显示：CAPRIN1表达上调能够有效促进恶性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭.

本研究结果显示：通过脂质体转染的方法在体外上调SGC-7901细胞CAPRIN1表达水平，能够明显增强细胞的增殖和迁移能力.进一步分析显示：与空白对照组、阴性对照组比较，研究组SGC-7901细胞中p-Akt和CyclinD1蛋白表达水平明显提高，说明CAPRIN1基因表达上调能够有效激活Akt信号通路和CyclinD1表达，进而增强SGC-7901细胞的增殖、迁移能力.相关研究结果[18]显示：CyclinD1是一个由CCND1基因编码的蛋白质，属于高保守的细胞周期家族，能够作用于细胞周期蛋白依赖性激酶，在不同周期蛋白中表现出不同的降解及表达特性，在维持有丝分裂过程中发挥作用.国外研究者[19-20]在分子层面上解析CAPRIN1结构发现，两个不同分子量的CAPRIN1分别与激素受体1和激素受体2相互结合，形成一个能够携带负电荷的二聚体蛋白，作为支架与GTP酶激活蛋白-Src同源结构域3-结合蛋白1特异性结合，形成多聚体，在肿瘤细胞增殖和迁移、肿瘤内环境的形成等多种复杂病理过程中发挥重要作用.由此可推测，CAPRIN1在胃癌细胞周期调控中发挥作用，同时能够特异性结合多种mRNA和蛋白，可能是一种原癌基因或癌相关基因.

综上所述，通过脂质体转染技术上调CAPRIN1表达能够明显提升胃癌细胞的增殖和迁移能力，可能与激活Akt信号通路和CyclinD1蛋白有关.在胃癌分子靶向治疗中可通过靶向作用使CAPRIN1表达下调，进而抑制Akt信号通路和CyclinD1蛋白，发挥抗肿瘤活性.