基于NF-κB通路研究槲皮素对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响*

何亚磊，蔡叶锐，魏引，张金盈

1.云南省第三人民医院，云南 昆明 650011；2.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

缺血性心肌病是常见且危害较重的疾病之一，临床多采用冠脉介入、溶栓及动脉搭桥等治疗，以恢复缺血区心肌的血液供应，减少心肌梗死［1］。临床研究发现，发生心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）时，心肌组织存在炎性浸润、心肌细胞大量死亡及氧化应激等，进一步加重了心肌功能障碍和结构损伤。因此，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者术后减少MIRI对保护缺血心肌有重要的临床意义［2］。研究显示，减轻MIRI过程中的氧化应激及炎症反应可有效缓解冠状动脉粥样硬化性心脏病患者术后心肌损伤。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗高血压及抗动脉粥样硬化作用［3］。研究显示，槲皮素预处理可保护脂多糖诱导的小鼠急性肾损伤［4］，可抑制糖尿病大鼠心肌炎症小体的活性，降低炎症水平，改善糖尿病性心肌损伤［5］。同时，槲皮素还可改善H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤模型中细胞的损伤及凋亡［6］，但未见其对MIRI大鼠模型的相关研究。因此，本研究拟建立大鼠MIRI模型，以期从核转录因子kappa B（nuclear factor of kappa B，NF-κB）通路角度揭示槲皮素防治心肌梗死的作用及机制。

1 材料

1.1 动物85只SPF级雄性SD大鼠，7～8周龄，体质量180～250 g，购自北京维通利华生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2018-2-006。

1.2 药物与试剂槲皮素（质量分数≥98%，国药集团化学试剂有限公司，批号：C09S8Y53412）。白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（中国碧云天公司，批号分别为：20180413、20180309、20180506）；乳 酸 脱 氢 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶MB（creatine Kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司，货号分别为：bsk00031、bsk00121、bsk00015）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、超微量ATP酶（Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP）试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司，批号分别为：20180112、20180307）；兔抗鼠κB抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear factorκB kinase，IKK）、IκBα、NF-κB多克隆抗体（美国Abcam公司，货号分别为：ab151543、ab6752、ab14356）。

1.3 仪器SH11/YF-9型光学显微镜（日本Olypmus公司）；Genios多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；ChemiDoc TM XRS+凝胶成像仪器（美国Bio-Rad公司）；RM6240型超声心动仪（日本Olypmus公司）。

2 方法

2.1 MIRI大鼠模型制备与分组将85只雄性大鼠按体质量随机分为5组：假手术组、模型组及槲皮素低、中、高剂量（25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1）组，每组17只，模型组及槲皮素各剂量组均建立MIRI模型。大鼠禁食不禁水12 h，给予10%乌拉坦麻醉，仰卧位固定，气管连接呼吸机，标准肢体Ⅱ导联实测心电图。75%乙醇左胸部消毒，剪开胸部，暴露心脏及表面血管，插入线栓造成心脏缺血30 min，剪开结扎线再灌注40 min建立MIRI模型［7-8］，其中假手术组仅分离前降支，不结扎。以收紧结扎线后大鼠的标准导联心电图ST-T段抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上为MIRI模型建立成功。各组给予相应的药物，假手术组及模型组则给予同体积生理盐水，连续给药7 d。

2.2 检测指标

2.2.1 测定大鼠心脏功能于末次给药12 h后，采用超声心动仪检测大鼠左心功能，记录左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

2.2.2 观察大鼠心脏病理学及心梗死面积百分比变化心脏功能测定完成后，每组随机选3只大鼠，摘除心脏，用10%福尔马林固定，蜡块包埋后并切片，行HE染色，在光镜下观察病理学变化［9］。每组随机选3只大鼠，取心脏，-20℃冷冻30 min后，行TTC染色，正常心肌组织呈红色、梗死区呈灰白色。采用Image J软件计算心肌组织梗死面积百分比。

2.2.3 检测大鼠的心肌损伤指标每组随机选8只大鼠腹主动脉取血，室温静置20 min，2 000 r·min-1离心10 min后，检测血清中LDH及CK-MB水平。

2.2.4 检测大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平检测上述大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.2.5 检测心肌组织中SOD、MDA及Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP酶活力将取血后的8只大鼠，取心脏，制备10%心肌组织匀浆（心肌组织∶生理盐水＝1∶9），4℃、4 000 r·min-1离心10 min，抽取组织上清液，测定MDA、SOD及超微量ATP酶（Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP）活力。

2.2.6 检测大鼠心肌组织NF-κB通路相关蛋白表达水平每组随机选取3只大鼠，取左心室心肌组织，剪碎后加入RIPA组织裂解液，裂解20 min，10 000 r·min-1离心20 min，取上清，测定蛋白浓度，并变性。取各组蛋白上样，于12%的十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳后，电转至硝酸纤维膜，加入p-IκBα、p-IKK、p-NF-κB p65及IκBα、IKK、NF-κB p65和β-actin一抗（1∶1 000）、辣根过氧化物酶标记鼠抗兔二抗（1∶2 000），化学底物发光法显色，图像扫描分析。显影的条带采用Image-QuaNT软件测量其灰度值，用目标蛋白与β-actin灰度值的比值表示蛋白表达［10］。

2.3 统计学方法用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用One-Way ANOVA检验，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 槲皮素对MIRI模型大鼠心功能的影响与假手术组比较，模型组LVEF、LVFS均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素中、高剂量组LVEF、LVFS均显著升高（P＜0.01），槲皮素低剂量组LVEF、LVFS均明显升高（P＜0.05）。提示槲皮素可明显增强MIRI大鼠的心肌收缩力，改善心脏功能。见表1。

表1 槲皮素对MIRI模型大鼠心功能的影响 （±s）

表1 槲皮素对MIRI模型大鼠心功能的影响 （±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

LVEF/% LVFS/%假手术组组别 n 17 88.42±4.41 58.76±4.81模型组 17 52.17±3.47** 33.29±3.19**槲皮素低剂量组17 58.28±4.41＃ 38.37±2.28＃槲皮素中剂量组17 67.67±3.89＃＃ 44.46±3.82＃＃槲皮素高剂量组17 79.29±4.47＃＃ 52.65±2.68＃＃

3.2 槲皮素对MIRI模型大鼠心脏病理学及心脏梗死面积百分比的影响假手术组大鼠心肌纤维排列整齐，无纤维断裂及炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌纤维结构杂乱，存在心肌纤维断裂及炎性浸润；槲皮素低、中、高剂量组大鼠心肌组织中炎症细胞明显减少，心肌损伤得到显著缓解。见图1。

图1 槲皮素对MIRI模型大鼠心脏病理学的影响（HE）

与假手术组比较，模型组大鼠心脏梗死面积百分比显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素中、高剂量组大鼠心脏梗死面积百分比均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），槲皮素低剂量组无显著差异（P＞0.05）。提示槲皮素可显著改善MIRI大鼠造成的炎症浸润及心肌梗死损伤。见表2、图2。

图2 槲皮素对MIRI模型大鼠心脏梗死面积百分比的影响（TTC）

表2 槲皮素对MIRI模型大鼠心脏梗死面积百分比的影响 （±s）

表2 槲皮素对MIRI模型大鼠心脏梗死面积百分比的影响 （±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

/%假手术组组别 n 心肌梗死面积百分比3.31±1.27模型组 3 48.26±5.47**槲皮素低剂量组 3 45.28±4.64槲皮素中剂量组 3 32.17±3.79＃槲皮素高剂量组 3 20.35±5.03 3＃＃

3.3 槲皮素对MIRI模型大鼠血清炎症因子水平影响与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素中、高剂量组大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；槲皮素低剂量组的IL-1β、IL-6水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α水平无显著差异（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s，ng·L-1）

表3 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s，ng·L-1）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 n IL-6 IL-1β TNF-α 8 33.26±4.02 220.48±14.89 1.25±0.31模型组 8 76.64±6.58**401.86±42.64** 3.28±0.51*槲皮素低剂量组 8 68.18±3.46＃ 350.68±21.39＃＃ 3.18±0.28槲皮素中剂量组 8 55.48±4.42＃ 296.29±23.85＃＃ 2.39±0.42＃槲皮素高剂量组 8 40.21±3.67＃ 248.49±16.88＃＃ 1.68±0.34假手术组＃

3.4 槲皮素对MIRI大鼠心肌损伤标志物及自由基氧化损伤标志物的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清中LDH及CK-MB水平均显著升高（P＜0.01），心肌组织中SOD活性显著降低（P＜0.01）、MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素低、中、高剂量组大鼠血清中LDH、CK-MB水平显著降低（P＜0.01），心肌组织中SOD活性显著升高（P＜0.01）、MDA水平明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠心肌损伤标志物及自由基氧化损伤标志物的比较 （±s）

表4 各组大鼠心肌损伤标志物及自由基氧化损伤标志物的比较 （±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

组别 n LDH/U·L-1 CK-MB/U·L-1 SOD/kU·g-1 MDA/mol·g-1±1.22模型组 8 417.81±56.73** 150.86±12.65** 79.65±9.26** 17.28±2.01**槲皮素低剂量组 8 320.51±32.81＃＃ 102.76±14.49＃＃ 90.71±7.96＃＃ 13.76±1.79＃槲皮素中剂量组 8 268.48±27.94＃＃ 78.97±8.71＃＃ 128.79±9.95＃＃ 9.96±1.36＃槲皮素高剂量组 8 189.72±31.75＃＃ 56.98±7.67＃＃ 150.66±11.21＃＃ 7.79±1.17假手术组 8 141.32±22.46 42.52±7.62 189.31±15.78 6.62＃＃

3.5 槲皮素对MIRI大鼠心肌超微量ATP酶活力的影响与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，槲皮素低、中、高剂量组Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力均明显升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠心肌组织Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力的比较 （±s）

表5 各组大鼠心肌组织Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力的比较 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05

组别 n Na+-K+-ATP/U·mgprot-1 Ca2+-ATP/U·mgprot-1 8 8.44±1.69 0.26±0.02模型组 8 5.12±1.37* 0.11±0.01*槲皮素低剂量组 8 7.32±1.58＃ 0.31±0.04＃槲皮素中剂量组 8 10.24±2.79＃ 0.34±0.05＃槲皮素高剂量组 8 11.18±2.57＃ 0.46±0.07假手术组＃

3.6 槲皮素对MIRI大鼠心肌组织NF-κB通路相关蛋白表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠心 肌 组 织 中p-IκBα/IκBα、p-IKK/IKK及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素各剂量组心肌组织中p-IκBα/IκBα、p-IKK/IKK及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均显著降低（P＜0.01）。见表6、图3。

表6 各组大鼠心肌组织NF-κB通路相关蛋白表达的比较 （±s）

表6 各组大鼠心肌组织NF-κB通路相关蛋白表达的比较 （±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01

组别 n p-IKK/IKK p-IκBα/IκBα p-NF-κBp65/NF-κ Bp65假手术组3 0.34±0.01 0.16±0.02 0.12±0.01模型组 3 6.63±0.52**5.78±0.43** 6.02±0.49**槲皮素低剂量组 3 4.44±0.31＃＃3.66±0.34＃＃ 4.17±0.33＃＃槲皮素中剂量组 3 2.68±0.26＃＃2.28±0.17＃＃ 3.05±0.26＃＃槲皮素高剂量组 3 1.33±0.08＃＃0.97±0.04＃＃ 1.19±0.11＃＃

图3 槲皮素对MIRI大鼠心肌组织NF-κB通路相关蛋白表达图

4 讨论

缺血性心肌病为近年来居民急性死亡的主要原因之一，其治疗过程的缺血再灌注会进一步加重心肌功能障碍和结构损伤［10］。槲皮素为黄酮类化合物，具有抗高血压、抗氧化应激损伤及改善内皮功能等作用［3］。在构建的H9c2心肌细胞缺氧复氧模型中，槲皮素能明显降低缺氧复氧后心肌细胞LDH及NO的释放，减少心肌细胞损伤及凋亡［11］。

本研究发现，槲皮素可明显增强MIRI大鼠的心肌收缩力，改善心脏功能，有效减轻心肌组织炎症反应和心肌细胞水肿，改善心肌梗死面积百分比。提示槲皮素对MIRI模型大鼠具有明显的保护作用，且随着槲皮素剂量的增加，其保护作用愈加明显。另有研究显示，槲皮素还可减轻压力超负荷大鼠左心室肥厚程度及心肌纤维化程度［12］。CK-MB和LDH为检测心脏疾病的经典生物标志物，当心肌细胞损伤时，心肌通透性增加，两者由胞质释放到细胞外，因此两者在血清中的浓度越高，心肌损伤越严重［13-14］。槲皮素干预后可明显降低大鼠血清中CK-MB、LDH水平，这反映槲皮素可改善MIRI模型大鼠的心肌损伤。

研究表明，心肌MIRI与炎症反应、氧自由基的过量产生有密切关联［15］。IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子，能促进心肌组织炎性浸润，刺激其他炎症因子表达，加剧心肌炎症反应［16-17］。研究表明，槲皮素对卵清蛋白诱导的小鼠支气管哮喘具有明显的抗炎作用［18］，对上述促炎症因子同样有显著影响。本研究发现，槲皮素可明显降低MIRI模型大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α水平，提示槲皮素可显著改善MIRI诱导的炎症反应，且随槲皮素剂量的增加其抗炎作用愈加明显。

SOD是氧化应激诱导的内源性自由基清除酶，其在预防缺血再灌注期间氧化应激损伤中有关键作用；MDA是氧自由基与细胞膜脂质的氧化产物，其水平越高表示氧化损伤越严重，两者均为评估心肌氧化应激水平的指标［19-20］。本研究发现，槲皮素可使MIRI模型大鼠心肌组织中SOD活性升高，MDA水平显著降低，表明其可通过清除氧自由基、增强心肌抗氧化酶活性来减少外周血中心肌酶含量，从而缓解MIRI造成的心肌组织损伤。

当MIRI诱导心肌损伤时，可出现心肌细胞的过度收缩和线粒体通透性转换孔开放，出现线粒体钙超载和细胞内钙超载，而Ca2+-ATP及Na+-K+-ATP两种超微量ATP酶为维持心肌细胞内离子稳态的重要物质，抑制两种酶的活性可使Ca2+转运能力下降，出现细胞内钙超载［21-23］。在本研究中，MIRI模型大鼠心肌组织Ca2+-ATP及Na+-K+-ATP酶活力降低，而槲皮素可显著增加超微量ATP酶活力，使Ca2+外排，降低心肌细胞内Ca2+含量，避免心肌细胞内钙超载，从而减少MIRI诱导的氧化应激损伤。

研究显示，NF-κB p65蛋白及其抑制性蛋白IkBα在炎症反应、细胞凋亡中发挥着重要的作用。MIRI诱导的氧化应激反应除了能直接发挥细胞毒性作用外，还能作为信号分子调控某些相关基因的表达，其中NF-κB通路的活化是氧化应激的主要作用靶点［24-25］。本研究发现，槲皮素可显著抑制p-IκBα、p-IKK及NF-κB p65水平，表明槲皮素可显著抑制MIRI大鼠NF-κB通路的激活，从而减轻氧化应激造成的心脏损伤。

综上所述，槲皮素可显著减轻MIRI引起的心肌损伤，改善心脏功能，抑制心肌组织炎症反应和氧化应激反应，其作用机制可能与增强超微量ATP酶活力及抑制NF-κB通路有关。