基于JAK-STAT通路研究槲皮素对人宫颈癌C-33A细胞的影响*

王慧玲，赵维楠，罗瑞，崔平平，郭瑞霞

1.许昌市第二人民医院，河南 许昌 461000；2.许昌市中心医院，河南 许昌 461000

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，在常见恶性肿瘤中居第四位，严重危害患者身心健康［1］。近年来，我国宫颈癌病死率明显增加，同时患病人群趋向年轻化［2］。目前，临床上治疗宫颈癌主要以手术为主，配合放疗、化疗等，但其引起的创伤和不良反应较为严重，影响患者的生活质量［3］。槲皮素是黄酮类化合物，广泛存在松针、槐米、菟丝子等植物的叶、花及果实中，具有较高药用价值［4］，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫抑制、保护心血管等作用。近年来发现，槲皮素对多种肿瘤细胞增殖有抑制作用［5-6］。本研究通过观察槲皮素对人宫颈癌C-33A细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，旨在明确其对C-33A细胞的作用机制，以期为临床槲皮素药物的开发及宫颈癌的有效治疗提供理论参考。

1 材料

1.1 细胞系人宫颈癌C-33A细胞（美国ATCC公司，货号：YB-ATCC-9284）。

1.2 药物与试剂槲皮素（含量≥95%，货号：Q4951-10G）、噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂（货号：M2128-1G）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（货号：D5879）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（货号：10099-141）、Annexin V-异硫氰酸荧光素（flourescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062S）、兔抗人蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase 2，JAK2）抗体（货号：ab108596）、p-JAK2抗体（货号：ab219728）、信号传导及转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗体（货号：ab68153）、p-STAT3抗体（货号：ab267373）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（货号：ab6721）均购自美国Abcam公司。

1.3 仪器TE2000-U型倒置生物显微镜（日本Nikon公司）；TY1218型FACSCalibu流式细胞仪（美国BD公司）；Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；1658033型垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 细胞培养取常规冻存复苏的人宫颈癌C-33A细胞，接种于含10%FBS、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640培养基中，置于5%CO2培养箱，37℃培养。2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞药物处理及分组用DMSO将槲皮素配制成1 mmol·L-1浓度的母液，-20℃保存备用；实验时用RPMI 1640培养基稀释槲皮素母液，使培养基中槲皮素浓度分别为20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1，DMSO最终浓度＜0.1%。将对数生长期的人宫颈癌C-33A细胞分为对照组（DMSO）、20μmol·L-1组（DMSO+20μmol·L-1槲皮素）、40μmol·L-1组（DMSO+40μmol·L-1槲皮素）、80μmol·L-1组（DMSO+80μmol·L-1槲皮素）。

2.3 检测细胞抑制率取对数期细胞，PBS冲洗，胰酶消化5 min，加入RPMI 1640培养基调节细胞密度为105mL-1，接种于96孔板。细胞贴壁后，对照组、20μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80μmol·L-1组更换相对应的培养基，每孔200μL，分别培养24 h、48 h、72 h。在各时间段结束前4 h按每孔20μL加入5 g·L-1MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150μL DMSO，充分震荡10 min，用酶标仪于490 nm测定各孔的光密度（A）值，每组每个时间点均设置5个复孔，计算抑制率。

抑制率（%）＝（对照孔A值-用药孔A值）/对照孔A值×100%

2.4 检测细胞凋亡情况取对数期细胞经胰酶消化后，调节细胞密度为106mL-1，接种于6孔板，细胞贴壁后，分别更换为相对应的培养基，常规培养48 h。胰酶消化后收集各组细胞，室温2 000 r·min-1离心5 min（离心半径10 cm），弃去上清，加4℃PBS漂洗，加入195μL Binding buffer重悬细胞，加入5μL AnnexinV-FITC 4℃避光孵育15 min，加入10μL PI染色5 min，置于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每组均设置5个复孔。

2.5 细胞周期的检测将各组细胞经胰酶消化后，按5×105mL-1接种于6孔板，细胞贴壁后，分别更换相对应的培养基，培养48 h后，用胰酶消化后收集各组细胞，1 000 r·min-1离心5 min（离心半径10 cm），用预冷PBS漂洗2次后，加入70%预冷的乙醇，4℃固定过夜，1 000 r·min-1离心5 min（离心半径10 cm），PBS漂洗2次，用核糖核酸酶消化30 min，用PI染液避光染色30 min，使用流式细胞仪进行细胞周期检测。每组均设置5个复孔。

2.6 检测细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达取对数期细胞，调节密度为106mL-1接种于培养瓶中，细胞贴壁后各组更换相对应的培养基，培养48 h后，收集细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，每孔加入蛋白样品40μL，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至PVDF膜上，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，用5%脱脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀释的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin一抗，4℃摇床孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶4 000相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，摇床室温孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入ECL超敏发光液，应用凝胶成像系统显影、定影，分析条带结果。

2.7 统计学方法采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 槲皮素对细胞增殖的影响与20μmol·L-1组比较，40μmol·L-1组、80μmol·L-1组的24 h、48 h、72 h抑制率均升高（P＜0.05），且80μmol·L-1组各时间抑制率明显高于40μmol·L-1组（P＜0.05）。20μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80μmol·L-1组抑制率均随时间延长而增加（P＜0.05）。见表1。

表1 槲皮素对细胞增殖的影响 （±s，n＝5，%）

表1 槲皮素对细胞增殖的影响 （±s，n＝5，%）

注：与20μmol·L-1组比较，*P＜0.05；与40μmol·L-1组比较，△P＜0.05；与24 h抑制率比较，a P＜0.05；与48 h抑制率比较，b P＜0.05

抑制率20μmol·L-1组 16.52±1.76 33.21±3.64a 42.61±4.57ab组别 24 h抑制率 48 h抑制率 72 h 40μmol·L-1组 27.98±2.94*45.68±4.87*a 53.82±5.61*ab 80μmol·L-1组 35.74±3.75*△54.19±5.68*△a 64.57±6.75*△ab

3.2 细胞凋亡率比较与对照组比较，20μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80μmol·L-1组细胞凋亡率均升高（P＜0.05）；与20μmol·L-1组比较，40μmol·L-1组、80μmol·L-1组细胞凋亡率均升高（P＜0.05）；80μmol·L-1组细胞凋亡率高于40μmol·L-1组（P＜0.05）。见图1。

图1 槲皮素对细胞增殖的影响

3.3 槲皮素对细胞周期的影响与对照组比较，20μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80μmol·L-1组G1期细胞百分率均升高，S期、G2/M期细胞百分率均降低（P＜0.05）；与20μmol·L-1组比较，40μmol·L-1组、80μmol·L-1组G1期细胞百分率均升高，S期、G2/M期细胞百分率均降低（P＜0.05）；80μmol·L-1组G1期细胞百分率高于40μmol·L-1组，S期、G2/M期细胞百分率低于40μmol·L-1组（P＜0.05）。见表2，图2。

表2 槲皮素对细胞周期的影响 （±s，n＝5，%）

表2 槲皮素对细胞周期的影响 （±s，n＝5，%）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与20μmol·L-1组比较，△P＜0.05；与40μmol·L-1组比较，◇P＜0.05

组别 G1期 S期 G2/M期45.23±5.16 24.37±2.57 29.61±2.84 20μmol·L-1组53.46±5.73* 20.13±2.64* 25.36±2.57*40μmol·L-1组62.51±6.79*△16.49±1.82*△ 20.82±2.03*△80μmol·L-1组73.16±7.35*△◇13.18±1.68*△◇15.47±1.72对照组*△◇

图2 槲皮素对细胞周期的影响

3.4 槲皮素对细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平的影响与对照组比较，20μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80μmol·L-1组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平明显降低（P＜0.05）；与20μmol·L-1组比较，40μmol·L-1组、80μmol·L-1组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平均降低（P＜0.05）；80μmol·L-1组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平低于40μmol·L-1组（P＜0.05）。见表3，图3。

表3 细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平比较 （±s，n＝5）

表3 细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平比较 （±s，n＝5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与20μmol·L-1组比较，△P＜0.05；与40μmol·L-1组比较，◇P＜0.05

p-JAK2/JAK2 p-STAT3/STAT3对照组组别0.92±0.09 0.96±0.10 20μmol·L-1组 0.80±0.07* 0.70±0.07*40μmol·L-1组 0.60±0.05*△ 0.59±0.05*△80μmol·L-1组 0.45±0.04*△◇ 0.51±0.05*△◇

图3 各组细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达

4 讨论

宫颈癌严重危害女性身体健康，其病因复杂，国内外流行病学及实验研究表明，感染人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宫颈癌发病的主要病因，尤其是高危型HPV持续感染是宫颈癌发病的主要危险因素之一［7-8］。目前宫颈癌的治疗手段较多，传统手术及放化疗方式治疗宫颈癌存在较多不良反应，长期化疗易引起肝肾毒性、神经毒性、骨髓抑制等，因此治疗宫颈癌应合理采用多种治疗方式相结合，对提高患者的治疗效果、改善预后及减少不良反应等有重要意义［9-10］。研究发现，多种中药的活性成分具有抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡的作用［11-13］。临床上使用中药治疗恶性肿瘤，具有广阔的应用前景。

肿瘤细胞显著特点是失控性和无限性，细胞增殖和凋亡在正常情况下保持着动态平衡，以维持生物自身稳定性，细胞增殖失控或者凋亡受阻都可导致肿瘤的发生［14-15］。细胞周期是细胞从上一次分裂完成开始到下一次分裂结束的整个过程，包括有丝分裂期（M期）和分裂间期（G1期、S期、G2期），细胞周期阻滞可减慢细胞增殖速度，诱导细胞凋亡［16-17］。体外实验证明，槲皮素可抑制胰腺癌、肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡，对肿瘤细胞发挥抑制作用［18-20］。体内实验研究显示，槲皮素可降低结直肠癌小鼠死亡率［21］。Liu等［22］研究显示，槲皮素可增加顺铂对乳腺癌荷瘤小鼠抗肿瘤敏感性，可作为化疗佐剂发挥抗肿瘤作用。另外，槲皮素具有影响肿瘤细胞周期分布的作用，并可诱导三阴性乳腺癌细胞周期阻滞［23-24］。槲皮素具有明显抗肿瘤活性，但其在宫颈癌中相关报道较少。本研究使用不同浓度槲皮素作用于宫颈癌C-33A细胞，结果显示，各浓度槲皮素组较对照组抑制率、凋亡率及G1期细胞百分率明显升高，S期和G2/M期细胞百分率明显降低，提示槲皮素可抑制C-33A细胞增殖，促进细胞凋亡，阻断细胞由G1期向S期转换，诱导周期阻滞，发挥抑制增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞作用。

JAK2/STAT3通路与细胞生长、分化和凋亡等过程关系密切。多种细胞因子可激活JAK2，JAK2磷酸化后激活下游STAT3活化为p-STAT3，使JAK2/STAT3信号通路持续活化，促进下游调控基因过表达，诱导肿瘤细胞形成、转化、浸润、迁移等，介导肿瘤发生发展过程［25-26］。研究显示，STAT3在卵巢癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞中表达异常，阻断STAT3表达可抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［27-28］。Lu等［29］研究表明，抑制JAK2/STAT3通路，可诱导人食道鳞状细胞癌细胞凋亡。Huang等［30］研究表明，抑制JAK2/STAT3通路可诱导骨肉瘤细胞G0/G1期阻滞促进其凋亡，抑制细胞侵袭。本研究发现，各浓度槲皮素组较对照组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显下降，表明槲皮素可能参与调控JAK2/STAT3通路的激活。

综上所述，槲皮素能抑制人宫颈癌C-33A细胞增殖，诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞，其机制可能是通过阻断JAK2/STAT3通路，为临床槲皮素药物的开发及宫颈癌的治疗提供一定理论参考。