基于UPLC/Q-TOF-MS联用技术探讨糖尿病气阴两虚证生物标志物*

杨宇峰，石岩

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种由多种原因引起的以血糖升高为特征的慢性代谢性疾病。胰岛素分泌不足（绝对或相对）以及靶组织或器官对胰岛素敏感性的降低皆可导致本病的发生。《中国2型糖尿病防治指南（2020版）》中最新调查数据显示，我国DM发病率目前已高达11.2%，且近年来呈明显上升趋势［1］。DM患者中以2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）为主，中医药治疗DM尤其是T2DM的临床优势突出，具有鲜明的诊疗特色，T2DM可以参照中医内科疾病中的消渴病辨证论治。消渴病多以禀赋异常、过食肥甘、多坐少动，以及精神因素为发病原因，具体病机主要为内热，内热不仅可伤阴，又可耗气，则成气阴两虚结热之局，“伤阴耗气”成为糖尿病病变的重要机理，贯穿疾病整个生物学变化过程［2］。

代谢组学是指通过对生物样本中的低分子量代谢物（谱）进行定性和定量研究，从而反映机体的代谢物图谱，揭示生命活动代谢本质，属于后基因时代的一门新兴“组学”学科。与基因组学、转录组学、蛋白组学相比，代谢组学能够更加准确、直观地描述机体的生理和生化状态。目前，代谢组学已经用于评价实验动物模型、判别中医证型和评价药物在体内靶器官的效应产生及一系列代谢过程和作用机制，在模型识别和确证、作用机制研究等方面具有理论意义和应用价值［3］。

本次研究以T2DM气阴两虚证动物模型为研究对象，通过超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪（Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS）联用技术分析各组模型大鼠差异代谢产物的种类及变化情况，确定其所具有的特征性“信息谱”，查找潜在的生物标志物，并与其分子基础相关联进行生物信息分析，以期阐明T2DM气阴两虚证候的生物学物质基础。

1 材料

1.1 实验试剂甲醇、乙腈，色谱纯（美国Merck KGaA公司生产）；甲酸，色谱纯（美国Tedia公司生产）；链脲佐菌素（批号：STZ-S0130，北京邦定泰克生物技术公司），其他试剂均为市售分析纯。

1.2 实验仪器超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（购自美国Waters公司），台式离心机（型号：JX0130-F000，购自日本Kubota公司，离心半径5 cm），超纯水仪（型号：Milli-Q Advantage A10，Merck KGaA公司）。

1.3 动物雄性健康SPF级周龄10～12周的SD大鼠30只，体质量（180±20）g，购自辽宁长生生物科技有限公司，饲养于辽宁中医药大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK（辽）2004-0019。实验室的温度湿度保持在正常范围内，通风良好，每天明暗各12 h。

2 方法

2.1 分组与造模大鼠用SPF级大鼠维持饲料适应性喂养1周后，用随机数字表法分为正常组、模型组，每组15只。模型组全程喂饲高脂高糖饲料，灌服200%青皮附子浓煎液（5 mL·kg-1·d-1），4周后，禁食不禁水12 h后腹腔注射小剂量STZ（30 mg·kg-1）。正常组给予普通饲料，灌服生理盐水（5 mL·kg-1·d-1），4周后，腹腔注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。

2.2 模型评估标准（1）T2DM成模标准：①体质量显著减少；②空腹血糖升高；③餐后血糖升高；④胰岛素抵抗。（2）中医证候成模评估标准：①精神萎靡，倦怠懒动；②体毛光亮度减退；③饮水增多，拉尾排便；④舌胖大，舌红少津，苔白润。同时符合以上4项中的3项或全部者即可确定为T2DM气阴两虚证模型。

2.3 样本制备与处理将符合评估标准的模型大鼠和正常组大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，剂量为3 mL·kg-1，然后进行腹主动脉取血。室温静置1 h并进行抗凝处理后，予10 000 r·min-1离心后取其上清液，冻存于-80℃冰箱。UPLC-Q-TOF-MS测定前，于室温下解冻，取样品100μL，加入色谱级乙腈-甲醇（1∶1）400μL，混匀振摇1 min，于4℃条件下进行12 000 r·min-1离心10 min，取200μL上清液进样分析。

2.4 检测条件①整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，进样量5μL，柱温40℃，流速0.4 mL·min-1；色谱流动相A：水+（体积分数）0.1%甲酸，色谱流动相B：乙腈+（体积分数）0.1%甲酸。②质谱条件：每份样品分别采用电喷雾电离（ESI）进行正离子和负离子模式检测，以氮气作为雾化、锥孔气，飞行管检测模式V型。其ESI源条件如下：离子源温度（source temperature）100℃、毛细管电压（capillary voltage）3 KV、锥孔电压（cone voltage）35 KV。离子扫描时间（Ion scan time）0.03 s，间隔时间（Interval time）0.02 s，数据采集范围（Range of data collection）：50～1 000 m/z。

2.5 数据分析将所获得的原始数据经MarkerLynx进行预处理后，获取三维矩阵图。应用软件SIMCA-P11.5进行多维统计分析，包括无监督主成分分析（principal component avalysis，PCA）分析、有监督偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根据t检验（P＜0.05）及VIP值＞1筛选潜在差异化合物。

3 结果

3.1 原始色谱图检查将所有质控样本正、负离子检测模式下的质谱总离子流图分别进行谱图叠加比较，如图1所示：各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明整个实验过程中仪器误差引起的变异较小，数据质量可靠。

图1 模型组和正常组大鼠血清样本UPLC/Q-TOF-MS总离子流图

3.2 模式识别分析采用PCA和PLS-DA方法对全部样本的UPLC/Q-TOF-MS数据进行分析，图2为PCA分析结果，模型组和正常组样本出现明显的分离趋势，图3为进行PLS-DA方法分析的结果，同样模型组和正常组样本出现明显的分离趋势，说明两组的代谢物存在显著差异。通常情况下如果R2和Q2越接近1，则表明模型越稳定可靠，反之可靠性较差，本次实验的结果为（R2X＝0.728，R2Y＝0.918，Q2＝0.953），说明其数据可靠性极高。

图2 两组大鼠血清样本PCA分析图（n=6）

图3 两组大鼠血清样本PLS-DA分析图（n=6）

3.3 显著性差异代谢物的筛选根据模型组和正常组大鼠血清生物标记物进行PCA聚类loading图的分析结果及离原点越远的点对分组贡献最大的原则，同时满足VIP＞1、t检验（P＜0.05），筛选差异显著的代谢产物，如图4所示。检索人类代谢组学数据库（human metabolome database，HMDB）和京都基因与基因组百科全书数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）鉴定差异代谢物，结果发现，与正常组相比，模型组大鼠血清有41种代谢物变化较为显著，如表1所示。支链氨基酸等代谢物水平显著降低，硬脂酸等代谢物水平显著上升。

图4 模型组和正常组大鼠血清样本PCA聚类Loading图

表1 筛选出的潜在生物标志物及其变化趋势

3.4 代谢通路分析将上述经筛选得到的生物标志物导入到Metaboanalyst 4.0数据库进行分析，结果发现有6条通路与疾病相关，分别为：三羧酸循环、蛋白质、脂质及能量和碳水化合物的代谢、氧化应激。碳水化合物代谢涉及糖原异生和糖原生成的合成代谢途径，以及糖原分解和糖酵解的分解代谢途径。脂质代谢涉及脂肪酸生成及氧化分解代谢途径。蛋白质代谢涉及氨基酸合成代谢途径和氨基酸氧化分解代谢途径。

4 讨论

根据IDF在2019年发布的报告显示：中国的DM发病率居世界首位，预计到2045年支出在DM的费用约为1 820亿美元［4］。根据现代科学技术进行相关实验研究其发病机制，开发出疗效良好且价格低廉的药物是有关DM研究的热点。代谢组学可以对一定生理状态或特定条件下的样本中所有代谢物进行综合全面、无偏性的高覆盖检测，可寻找和鉴定出不同样品的差异代谢物，从而实现代谢特征的比较［5］，为精准研究T2DM常见中医证型-气阴两虚型模型大鼠与正常大鼠的差异代谢产物提供了可行性。

本研究使用STZ联合高脂饲料诱导T2DM大鼠模型，STZ是一种亚硝基脲类似物，1963年首次被报道具有DM的致病性［6］，其小剂量单次给药适合诱导T2DM模型，肥胖是T2DM重要的病因［7］，DM尤其是T2DM早期患者大多会出现以高胰岛素血症、胰岛素抵抗和血脂异常为特征的肥胖状态［8-9］，故在STZ注射前使用高脂饲料全程喂养是造模成功的关键因素。相关文献还显示：8周高脂饲料喂养后进行STZ造模后生活质量较差，4周更佳，并可减少死亡率，节约实验成本［10］；SD大鼠造模死亡率小于Wistar大鼠［11］；雄性大鼠比雌性大鼠对于STZ更加敏感［12-13］。上述研究结果可以作为本次小剂量STZ诱导的参考依据。使用青皮附子浓煎液灌胃可以最大程度真实模拟T2DM“伤阴耗气”的发病过程，为目前气阴两虚证型造模的最佳选择。

本实验研究发现与正常组相比，T2DM气阴两虚证模型的代谢表达谱有明显差异，其中11条与脂质代谢相关，10条与蛋白质代谢相关，8条与碳水化合物代谢相关，7条与氧化应激损伤代谢相关，5条与能量代谢相关。

4.1 碳水化合物代谢与正常组相比，模型组乳酸（lactic acid），山梨糖醇（sorbitol），D-塔格糖（Dtagatose）的水平显著增加；1，5-脱水葡萄糖醇（1，5-anhydroglucitol，1，5-AG），D-赤藓糖（Derythrose），D-半乳糖，磷酸葡萄糖酸内酯（gluconophosphate），1，6-二磷酸果糖（1，6-phosphate fructose）水平显著降低。这些代谢产物与乳糖降解、多元醇代谢、半乳糖代谢、戊糖磷酸途径、糖酵解代谢、糖异生等密切有关。其中山梨糖醇是葡萄糖的醛基还原而形成的山梨醇与半乳糖醇，模型组高血糖引起的异常山梨醇代谢增加了山梨醇在机体内的蓄积。1，5-AG是一个反映长期血糖稳定控制的标志物，在血清水平与循环葡萄糖成反比［14］，其在模型组内的水平显著下降，一方面反映模型的复制成功，另一方面提示模型组大鼠存在严重的糖代谢紊乱。

4.2 脂质代谢相关研究已经确定脂肪酸是糖尿病的独立预测因子。本实验在模型组中观察到多种游离脂肪酸（包括中链、长链、饱和、不饱和、多不饱和、支链和二羧酸脂肪酸）水平异常。其中模型组棕榈酸（palmitic acid）、硬脂酸（stearic acid）、油酸（oleic acid）、亚油酸（linoleic acid）、月桂酸（lauric acid）、甘油磷酸盐（glycerol phosphate）显著升高。棕榈酸是人体血清中丰富的饱和脂肪酸，研究报道棕榈酸水平与T2DM风险之间存在正相关［15］。月桂酸和甘油磷酸盐增加是由于脂肪组织中三酰甘油的快速动员导致血清游离脂肪酸水平增加。花生四烯酸代谢在T2DM的病理生理学中发挥潜在作用，花生四烯酸（arachidonic acid）可转化为前列腺素，白三烯和脂氧素，其中前列腺素-E和白三烯是有效的促炎性脂质介质［16］。模型组氧化脂质如5-羟过氧化二十碳四烯酸（5-hydroxyperoxytetradecanoic acid）是体内白三烯生物合成过程中，花生四烯酸到白三烯A4的中间物质，参与介导炎症并诱导白细胞在内皮上的黏附和活化。酰基肉碱（acylcarnitine）的升高可能与脂肪酸的β-氧化增加或肝脏和肌肉组织中的线粒体功能障碍有关，因为脂肪酸与肉毒碱的结合需要跨线粒体膜运输和随后的β-氧化［17］。3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid，AHB）的水平显著增加，研究表明AHB是胰岛素抵抗的重要标志物，是α-酮丁酸通过乳酸催化反应脱氢酶或α-羟基丁酸脱氢酶代谢的产物［18］。

4.3 蛋白质代谢胰岛素通过增加蛋白质合成速率并降低蛋白质降解速率，对蛋白质代谢发挥重要的调控作用。模型组大鼠的蛋白质分解代谢增强了胰岛素抵抗，升高的支链氨基酸BCAAs（异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸）以及一些芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）是人类和动物模型中T2DM的重要预测因子，BCAAs通过调控哺乳动物雷帕霉素复合物靶标（mTORC）影响胰岛素敏感性。已有研究表明BCAAs首先激活mTORC1和下游靶核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）［19］，S6K1通过抑制胰岛素受体底物1信号传导影响胰岛素敏感性［20］。BCAAs还可促进肝脏和骨骼肌中的葡萄糖摄取，增加糖原合成［21］。一些蛋白质转化产物如来自半胱氨酸的牛磺酸（taurine）和来自谷氨酰胺的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）也在模型组中升高，可能与模型组喂饲高脂高糖膳食破坏机体骨骼肌中的胰岛素信号传导，进而引起胰岛素抵抗有关。模型组甘氨酸（glycine）水平减少与胰岛素抵抗密切相关，胰岛素抵抗可导致机体δ-氨基乙酰丙酸合酶1表达增强，进而催化甘氨酸和琥珀酰-CoA缩合成5-氨基乙酰丙酸，从而降低甘氨酸水平［22］。

4.4 氧化应激研究表明T2DM气阴两虚证模型存在着明显的氧化应激损伤，氧化应激被认为在IR中起关键作用，IR情况下，线粒体β氧化能力处于饱和状态，这是由于脂质向肌肉组织的递送增加所致，从而使生物活性脂质衍生的代谢物如二酰基甘油（diacylglycerol）和神经酰胺（ceramide）在线粒体空间积累，并促进丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化来抑制IRS-1酪氨酸磷酸化［23］。实验发现的2-氨基己二酸（2-aminoadipate）是赖氨酸降解的中间代谢产物，具有胰岛素促分泌素的作用，并且已被认为是氧化应激的生物标志物［24］。除此，几种氧化应激标志物包括还原型谷胱甘肽（reduced glutathione），蛋氨酸砜（methionine sulfone）和蛋氨酸亚砜（methionine sulfoxide），羟基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecadienoic acid）也在模型组中被发现水平升高。

4.5 能量代谢T2DM气阴两虚证模型存在明显能量缺乏状态，其代谢特征最显著变化是葡萄糖氧化代谢减少和脂肪酸β氧化代谢增加，增加的脂肪酸氧化补偿葡萄糖氧化缺陷所产生ATP，表现为模型组柠檬酸（citric acid），L-苹果酸（L-malic acid），α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid），琥珀酸（succinic acid），富马酸（fumaric acid）与正常水平相比显著降低。模型组肌酸酐（creatinine）增加，表明磷酸肌酸中更多的高能磷酸键被转移形成ATP以满足能量需求，并证实了模型组存在三羧酸（TCA）循环异常。此外，模型组增加的3-羟基丁酸酯（3-hydroxybutyrate）（脂肪酸β-氧化和BCAA分解代谢产物）表明能量代谢改变与糖酵解破坏和脂解作用增加正相关［25］。

综上，本研究通过整体分析T2DM气阴两虚证模型生物样本中小分子代谢物，同时应用多维统计、生物信息学等数据挖掘技术并结合相关性研究，探寻T2DM气阴两虚证相关的代谢标记物和代谢模式，为揭示DM中医证型本质和阐明其发病机理提供了新的思路和依据，从而进一步促进DM中医证候分子机制的深入研究和探讨。