基于网络药理学和分子对接技术探讨芪参益气滴丸改善心肌缺血再灌注损伤的潜在分子机制*

王建茹，朱明军，王永霞，彭广操

河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

《中国心血管病报告2018》显示，我国心血管病患者多达2.9亿，防治心血管病给我国带来了严重的社会和医疗资源负担［1］。急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种急危重表现。近几十年来，随着我国经济的快速发展和生活方式的巨大变化，AMI急剧增加，已成为我国居民住院和死亡的主要原因［2］。早期快速恢复冠状动脉血流可减少心肌梗死的面积，防止进一步组织损伤。溶栓、经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）等再灌注策略的发展，极大降低了AMI后短期的病死率，但却增加了心肌缺血再灌注损伤（myocardium ischemia-reperfusion injury，MIRI）的发病率，加重了心脏结构和功能的损伤，最终可引起多种不良心血管结局［3］。因此，积极发掘有效延缓或逆转MIRI的措施，具有十分重要的临床和社会意义，一直是心血管领域研究的重点和热点。

中药复方具有多成分、多靶点、多途径和多效应的特点，在治疗疾病方面表现出疗效确切、不良反应小的优势，但其作用机制研究是一直以来的重点和难点［4］。现阶段，研究中药对某种疾病的作用机制，很难进行系统全面的研究，大多从单靶点或单一通路切入。网络药理学因具有整体性和系统性的特点，迎合中医学的整体观念，能更好地阐释中药复方治疗疾病的物质基础和潜在作用机制，已成为研究中药的新技术方法，并产生了一系列新的研究数据和成果［5］。分子对接技术作为一种广泛使用的虚拟筛选方法，可研究小分子配体与受体间的相互作用，预测其结合模式及亲和力［6］。现阶段，多项研究均采用网络药理学和分子对接技术探讨中药治疗某种疾病的物质基础和作用机制，并确定了这些技术方法的科学性和可行性［7-8］。芪参益气滴丸包括黄芪、丹参、三七和降香4味药，具有益气通脉，活血止痛的作用。目前，芪参益气滴丸在临床上已广泛用于冠状动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、PCI术后心肌损伤等多种心血管疾病的治疗，并表现出了良好的临床应用前景，但其生物分子机制尚需深入的探索研究［9-11］。

基于以上认识，本研究通过网络药理学和分子对接技术，揭示芪参益气滴丸改善MIRI的有效活性成分和潜在分子机制，以期为后续的基础实验研究提供新的研究思路，为临床研究提供一定的客观依据。

1 资料与方法

1.1 资料中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem数 据 库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）；GenCLiP 3数据库（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）；GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）；OMIM数据库（http：//www.omim.org/）；Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）；STRING数 据 库（https：//string-db.org/）；Veney 2.1软件；Cytoscape 3.7.2软件；R 3.6.1软件；PDB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/）；PyMOL 2.2.0软件；ChemBioDraw 2014软件；Discovery Studio 4.5软件；Autodock vina1.1.2软件；Autodock Tools 1.5.6软件等。

1.2 方法

1.2.1 获取并筛选芪参益气滴丸中相关化学成分及作用靶点在TCMSP数据库中收集芪参益气滴丸中黄芪、丹参、三七、降香的全部化学成分，收集相应化合物的预测作用靶点。口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是药物成分毒药物动力学（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）属性中最重要的药动学参数之一，代表口服药物的有效成分到达人体循环系统的速度和程度，是评价药物能否发挥药效的重要指标。类药性（drug likeness，DL）代表化合物成分与已知化学药的相似性，对确定中药成分是否对机体产生活性具有重要参考价值，DL值越高提示化合物的理化性质越稳定，药动学性质越好。本研究将OB≥30%和DL≥0.18作为条件进行筛选［8，12-14］。同时，在PubChem数据库中检索获取的芪参益气滴丸所有活性成分的Canonical SMILES结构。然后，在Swiss Target Prediction数据库对芪参益气滴丸活性成分的作用靶点进行预测，并以概率≥0.3为阈值进行靶点筛选。

1.2.2 筛选与MIRI相关作用靶点在Gene-Cards、OMIM、GenCLiP 3数据库中输入关键词心肌缺血再灌注损伤的英文名称即“myocardial ischemic reperfusion injury”；“myocardial ischemic-reperfusion injury”；“myocardial ischemia-reperfusion injury”；“myocardial ischemia reperfusion injury”检索已报道的与MIRI相关的靶点。

1.2.3 获取芪参益气滴丸-MIRI共同作用靶点利用Uniprot数据库对所有作用靶点进行标准化规范。将芪参益气滴丸中所有活性成分的作用靶点与MIRI相关作用靶点导入Veney 2.1软件中取交集，获取芪参益气滴丸-MIRI共同作用靶点，并绘制韦恩图。

1.2.4 构建蛋白-蛋白相互作用网络并筛选核心靶点将1.2.3项下得到的共同靶点上传至STRING数据库中，互作得分设置为最高置信度≥0.900，进行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并将结果保存为tsv格式。将导出的tsv文件中的node1、node2和combined score信息导入Cytoscape3.7.2软件中绘制PPI网络，用Network Analyzer工具进行网络分析，利用Generate style from statistics工具对节点大小和颜色进行设置用于反映度值的大小，对边的粗细进行设置用于反映Combine score的大小。将select选项下Node：degree的最小值设置为平均自由度的2倍，筛选核心靶点，最后选取新的核心PPI网络。

1.2.5 核心靶点富集分析利用Uniprot数据库将1.2.4项下筛选出的核心靶点的Uniprot号转换为entrez号。在R语言的环境下，利用org.Hs.eg.db、clusterProfiler、enrichplot等R程序包对核心靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并绘制条形图和气泡图进行可视化。

1.2.6 中药-成分-靶标-通路网络的构建结合已报道的文献研究，筛选出前30条通路中与MIRI最相关的通路，并找出富集在这些通路上的核心靶点。在Excel表中分别构建芪参益气滴丸“中药-活性成分”“活性成分-靶点”“靶点-通路”文件，并将以上文件输入Cytoscape3.7.2软件中，构建中药-成分-靶标-通路网络。

1.2.7 分子对接将degree排名前5位的核心靶点与其所对应的活性成分进行分子对接。首先，从PDB数据库中检索人源核心靶点的PDB号并下载pdb格式的蛋白结构，用PyMOL软件去除蛋白结构中的水分子、配体等，Auto dock Tools加氢，然后转换成pdbqt格式。其次，从Chempub数据库中下载各活性成分的分子结构，保存为SDF格式，再用ChemBio3D进行优化，保存为mol2格式。最后，利用Autodock Vina软件进行分子对接，获取结合能值，对接结果采用Discovery Studio Visualizer 4.5和PyMOL软件进行可视化。结合能数值为负则提示活性成分与核心作用靶点可自由结合，数值越小说明两者的作用关系越可靠。本研究将＜-5 kcal·mol-1的结合能数值作为阈值，来佐证活性成分与核心靶点之间作用关系的可信度。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸化学成分及其作用靶点在TCMSP数据库中以OB≥30%、DL≥0.18为条件进行筛选，丹参获得65个活性成分，黄芪为20个，三七为8个，降香为37个。将这130个活性成分进行汇总剔除重复后共得到125个活性成分。将125个活性成分分别在TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测，剔除重复项后共获得350个靶点。

2.2 疾病作用靶点从GeneCards数据库中检索到1 275个靶点；OMIM数据库中检索到21个靶点；GenCLiP3数据库中检索到722个靶点，剔除重复项后共获得1 475个与MIRI相关的作用靶点。

2.3 药物-疾病作用靶点的预测将芪参益气滴丸作用靶点与MIRI相关作用靶点，经过Uniprot数据库进行标准化后，导入Veney 2.1软件中取交集并构建韦恩图（见图1），最后共获得181个共同作用靶点，即芪参益气滴丸潜在改善MIRI的作用靶点。

图1 芪参益气滴丸-MIRI靶点韦恩图

2.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建与核心靶点的筛选将181个共同靶点导入STRING数据库中进行蛋白互作关系分析，再使用Cytoscape软件绘制PPI网络。该网络包括157个节点、23 260条边，平均Degree值为10.561，然后再以平均度值的2倍（22）进行第2次筛选，得到19个节点、342条边的新的PPI网络图，颜色越深、节点越大的圆形靶标节点表示度值越高，说明其在芪参益气滴丸改善MIRI方面的作用越重要，其中19个节点即是核心作用靶点（见图2、表1）。

图2 芪参益气滴丸改善MIRI共同作用靶点PPI网络图

表1 芪参益气滴丸“药物-疾病”相互作用网络中的核心靶点

2.5 核心靶点富集分析在Uniprot数据库中，将19个核心靶点的Uniprot号转换为entrez号，然后利用R包进行富集分析。GO功能富集分析结果显示，依据P≤0.05确定了1 871个GO条目。生物学过程（biological process，BP）条目最多为1 763条，主要涉及DNA结合转录因子活性的调控、氧化应激反应等。分子功能（molecular function，MF）条目为77条，主要涉及磷酸酶结合、丝裂原活化蛋白激酶活性等。细胞组分条目（cellular component，CC）为31条，主要涉及核染色质、膜筏等。图3依据计算出的p.adjust显著性列举了3个模块的前10个条目进行可视化。KEGG通路富集分析结果显示，依据P≤0.05共映射出了146条信号通路，主要有癌症相关通路、乙型肝炎、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信号通路、Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号通路等。根据通路所涉及靶点数目和p.adjust的显著性选取前30条通路，以气泡图的形式进行可视化，其中气泡的大小代表该通路的靶点数目，气泡颜色代表富集显著性（见图4）。

图3 芪参益气滴丸改善MIRI潜在核心靶点的GO富集分析条形图

图4 芪参益气滴丸改善MIRI潜在核心靶点的KEGG通路富集分析气泡图

2.6 中药-成分-靶点-通路网络的构建通过文献收集，在富集的前30条通路中筛选出了10条可能与MIRI相关的通路，即MAPKs信号通路、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信号通路、TLRs信号通路、低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、ErbB信号通路、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、松弛素信号通路、c型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路、催乳激素信号通路。此外，KEGG富集分析结果中细胞凋亡、磷酸肌醇3激酶（Phosphoinositol 3 kinase，PI3K）-苏氨酸蛋白激酶（threonine-protein kinases，AKT）信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路、转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）信号通路、核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路等虽未据前30位，但却与MIRI的病理过程密切相关。将这10条通路与芪参益气滴丸相应的活性成分、作用靶点进行整合，构建中药-成分-靶标-通路网络图（图5）。如图5所示，红色六边形节点代表芪参益气滴丸中的中药，黄色三角形节点代表活性成分，蓝色圆形节点代表潜在作用靶点，绿色V节点代表与MIRI密切相关的通路。由图5可知，芪参益气滴丸中的黄芪、丹参、三七、降香4味药中的57个活性成分通过干预19个作用靶点参与以上10条信号通路。

图5 芪参益气滴丸的中药-成分-靶点-通路网络图

2.7 分子对接结果为了验证芪参益气滴丸“中药-成分-靶点-通路网络”的预测结果，将核心作用靶点中度值排名前5位的靶点与其所对应的活性成分进行分子对接，对接的参数设置及相应的计算结果见表2。结果表明，提取出的16对“活性成分-作用靶点”关系中，芪参益气滴丸的活性成分与5个核心作用靶点均存在不同程度的结合，结合自由能均＜-5 kcal·mol-1，提示筛选出的核心作用靶点与其对应的活性成分具有良好的亲和力，说明结果具有一定的可信度。图6为度值排名第2位的核心作用靶点TP53与其对应活性成分的分子对接结果模拟图，其中丹参酮IIA与TP53的结合能力最强。

图6 TP53（1tsr）对接结果模拟图

表2 活性成分与作用靶点分子对接参数及相应计算结果

3 讨论

西医认为，MIRI的病理过程涉及钙超载、细胞凋亡、能量代谢障碍、氧化应激以及炎症反应等［15］。近年来，诸多研究已证实中药及其复方制剂在改善MIRI方面表现出了明显的临床优势和应用前景，其作用机制主要包括抗炎、抗氧化、抑制钙超载、改善心肌能量代谢、抑制细胞凋亡等［16］。中医学并没有MIRI概念的描述和记载，鉴于MIRI为AMI行PCI术后发生的重要病理过程，且临床常表现为心功能减退和心梗面积扩大等，故可将MIRI按中医“胸痹心痛”进行辨证论治。中医学认为MIRI的病机为本虚标实，且两者可相兼为病，本虚表现为气血阴阳的亏虚，标实则以血瘀、痰阻、气滞、寒凝多见，其中医辨证分型以气虚血瘀证最为常见，故可从益气活血法遣药组方论治MIRI［17-18］。芪参益气滴丸作为益气活血法的代表方剂，可减少PCI术后心血管事件的发生率，减轻患者症状，提高其活动能力和生活质量，并被推荐用于冠状动脉介入术后再狭窄、再发心绞痛和心血管事件的治疗以及PCI围手术期心肌的保护［19-21］。

本研究运用网络药理学方法，对芪参益气滴丸改善MIRI的药效物质成分和作用机制进行预测分析。结果显示，芪参益气滴丸中有125个活性成分分别能与181个药物-疾病共同靶点发生相互作用，经PPI网络拓扑分析后共筛选出19个核心作用靶点。同时，利用R程序包对这些核心作用靶点进行GO分析和KEGG分析。富集分析结果显示，芪参益气滴丸通过在核染色质、膜筏等部位，调控DNA结合转录因子活性、氧化应激反应等生物过程，发挥调节磷酸酶结合、MAP激酶活性等分子功能，达到改善MIRI的作用，涉及的信号通路主要包括MAPKs信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路、mTOR信号通路、TGF-β信号通路、NF-κB信号通路等。利用网络药理学所构建的“中药-成分-靶点-通路”网络显示，芪参益气滴丸的不同活性成分可对应同一个靶点，同时一个活性成分也可分别对应多个靶点，继而引发不同的生物学效应，这表明芪参益气滴丸在改善MIRI方面，表现出了多成分、多靶点、多效应的特点。分子对接结果显示，5个核心作用靶点和8个活性成分，共构成了16组对接关系对，关系对间亲和力良好，对接体系稳定。这些结果提示，芪参益气滴丸所含的活性成分具有调控MIRI相关靶点的生物活性，从侧面佐证了网络药理学预测结果的科学性和可靠性。

研究显示，芪参益气滴丸的多种活性成分可通过调控自噬相关通路改善MIRI，比如丹参素通过上调mTOR信号通路对MIRI发挥保护作用［22］；丹酚酸B防治MIRI的作用机制与PI3K/AKT信号通路调控的自噬有关［23］；人参皂苷Rg1通过激活PI3K/AKT/mTOR通 路 上 调HIF-1α改 善MIRI［24］。MAPKs信号通路介导MIRI病理，而芪参益气滴丸所含的活性成分黄芪多糖和丹参素，可分别通过下调p38MAPK信号通路，抑制p-JNK的活性来改善MIRI［25-26］。有研究报道，芪参益气滴丸的大量活性成分具有抗氧化应激的作用，可通过调控PI3K/AKT信号通路的表达水平和活性，拮抗MIRI导致的细胞凋亡；还可降低MIRI过程中TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κB等炎性因子的表达［27-28］。此外，芪参益气滴丸能通过抑制MIRI诱导的TGFβ信号通路的激活，改善其导致的心肌纤维化程度［29］。上述其他学者的研究结果与本研究所预测的芪参益气滴丸改善MIRI作用机制的部分结果相一致，这充分说明本次研究结果的可靠性和准确性。

综上所述，芪参益气滴丸改善MIRI是多靶点、多途径的复杂过程，本次研究结果为进一步探讨芪参益气滴丸改善MIRI的药效物质基础和作用机制提供了可能的研究方向。但由于TCMSP数据库和疾病数据库的不完善以及网络药理学研究自身局限性等因素的影响，本研究结果尚不能完全阐释芪参益气滴丸改善MIRI的生物学基础，仍需后续基础实验和临床试验研究的观察与佐证。