一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

刘师文，熊 英，施 勇，李健雄，王 倩，龚 甜

汉坦病毒(hantavirus， HV)是世界范围内分布的对人类有严重不良影响的人兽共患病原体[1]，其基因组由大(L)、中(M)、小(S) 3个分段的负义单链RNA组成。根据基因结构特点，已从动物和人类中发现的HV可分为50 多种基因型[2]，它们在自然宿主中不引起症状性感染，但是在人类中经常引起两类急性发作传染病，即肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征。据统计这两类疾病病死率分别可达15%和50%[3]。研究发现，HV感染严重程度与病毒型别、病毒RNA载量有关[4-5]。 中国是世界上HFRS疫情最严重国家，年报告病例数最高达到全世界90%，全国31 个省市自治区均有病例报告[6]。在我国，最主要流行的HV 为HTNV和SEOV。早诊断、早治疗对控制HFRS病死率非常关键。因此，建立HTNV 和SEOV双重实时荧光定量检测方法对病毒进行快速、准确、分型、定量检测，对指导HFRS临床救治、降低病死率有重要意义。目前HFRS病原荧光定量Realtime-PCR检测方法都存在一定的局限性。本研究在前期HV病毒分离、全基因组测序及构建的HTNV和SEOV 株S基因重组质粒菌株的基础上[7-8]，以纯化的重组质粒作为定量标准品，选择汉坦病毒的S基因为目的基因设计引物探针，建立可以快速对HTNV和SEOV进行分型和定量检测的双重实时荧光定量RT-PCR方法为HFRS早期诊断、疾病防控提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌、毒株及样品 pGEM®-T-SEOV和pGEM®-T-HTNV重组质粒DH5a菌株菌株为本实验室保存，分别以AYW89-15株(HTNV)和JiangxiXinjianRn-07-2011(SEOV)全S基因构建的重组菌株。血清样本为2017年HFRS 监测项目收集并于-80 ℃保存。

1.2 主要设备和试剂 荧光定量PCR仪(ABI7500型)，超……