吡虫啉对豌豆蚜抗感品系两种解毒酶活力的影响

郭耀霞，刘长仲，张廷伟，漆富苗，张东鹏

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

豌豆蚜(AcyrthosiphonpisumHarris)属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，分布于全球各地[1]，繁殖力很强，对我国北方豆类作物以及苜蓿生产造成重大威胁[2]，其危害除直接吸食寄主植物汁液外还传播多种病毒[3-4].目前，化学防治是防治豌豆蚜最有效的方法，而吡虫啉作为一种新型烟碱类杀虫剂，具有低毒、低残留、高效、广谱、内吸性等特点，被作为当前防治刺吸式害虫的高效药剂大量使用[5]，进而豌豆蚜对吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的抗性问题也将成为害虫防治中的首要任务.有关害虫对吡虫啉的抗性已有不少报道，如褐飞虱(Nilaparvatalugens)[6]、二斑叶螨(Tetranychusurticae)[7]、苹果黄蚜(Aphiscitricola)[8]、麦长管蚜(Sitobionavenae)[9-10]、棉蚜(Aphisgossypii)[11]、桃蚜(Myzuspersicae)[12]等.害虫抗性的形成与体内各种解毒酶系的活性变化有密切联系，如赵颖[13]等研究表明棉蚜的抗性程度与羧酸酯酶的活性呈正相关；高新菊[14]等研究表明随着二斑叶螨抗性增强，其体内的多功能氧化酶(multifunctional oxidase，MFO)活性也逐渐上升；汝阳[15]等研究发现二斑叶螨在对阿维菌素的代谢过程中，其体内谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GSTs)和MFOs起主要作用，羧酸酯酶(carboxy lesterase，CarEs)对阿维菌素的代谢影响较小.乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和CarEs作为昆虫体内重要解毒酶也曾被报道，如潘文亮等[16]研究了棉蚜对吡虫啉的低水平抗性是由于CarEs酶活性的增加造成的；李飞等[17]研究表明棉蚜抗性品系与敏感品系相比，乙酰胆碱酯酶的活力显著升高.当前在关于豌豆蚜抗性发展过程中，其解毒酶活性变化的研究报道较少，如王小强等[18]研究表明对豌豆蚜F1代进行药剂处理后，对其寿命和繁殖力均有抑制作用；陈小坤等[19]研究抗吡虫啉棉蚜种群对啶虫脒和噻虫胺的交互抗性及相关酶学机理，说明吡虫啉引起棉蚜种群靶标突变后，抗性棉蚜种群不仅达到了高抗水平，而且停药后很难再恢复至相对敏感水平；韩晓莉等[9]对麦长管蚜抗性品系和敏感品系进行了比较，发现随着选育世代增加，成蚜期和生殖期明显缩短，产蚜量逐渐下降.本研究参照潘文亮[16]和李飞等[17]研究棉蚜抗性品系体内CarEs和AChE活性升高时，棉蚜对吡虫啉产生低水平抗性，选择测定红绿两种色型豌豆蚜敏感品系和抗性品系体内AChE和CarEs活性变化规律，旨在了解豌豆蚜对吡虫啉产生抗药性的强弱以及抗性发展动态，为农业生产中吡虫啉的合理使用和豌豆蚜的综合防治提供科学的理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试虫源及植物

供试植物为蚕豆(ViciafabaL.)，豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)敏感品系种群采自甘肃农业大学苜蓿试验田，期间未接触过任何化学农药.豌豆蚜抗性品系是由敏感品系在室内经多代药剂处理培育获得.饲养时以蚕豆为寄主(接触药剂后每2代测定1次)，以敏感品系作为对照.

1.2 主要试剂及仪器

98.5%吡虫啉原药(青岛海利尔药业有限公司).乙酸-1-萘酯(天津市光复精细化工研究所)；碘化乙酰硫代胆碱(上海源叶生物科技有限公司)；固蓝RR盐(BIOSHARP)；牛血清蛋白(BSA，上海源聚生物科技有限公司)；毒扁豆碱(上海维塔化学药剂有限公司)；a-萘酚(天津市光复精细化工研究所)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司北京代表处)，离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司).

1.3 毒力测定

毒力测定方法采用联合国粮食及农业组织(FAO)推荐的带虫浸叶法[20].将吡虫啉原药用丙酮溶解后稀释成6个浓度梯度(0.1、0.25、0.5、1、2、4 mg/L)，将带有豌豆蚜的蚕豆叶片用纱布包裹后在不同浓度的药液中浸3～5 s后，放置在培养皿中自然凉干；置于温度24 ℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的光照培养箱中饲养，每浓度处理90头，每处理3次重复，以丙酮为对照.48 h后用毛笔轻触虫体检查结果，虫体附肢完全不动者记为死亡，统计不同色型豌豆蚜死亡数.用SPSS 16.0计算LC50值.

1.4 抗性品系的选育

豌豆蚜抗性品系的选育方法参照王开运[21]的测定方法(略有改动)，将吡虫啉采用喷雾法对豌豆蚜敏感品系进行喷雾处理，控制死亡率在70%左右，以存活个体继续扩繁，连续选育6代，诱导得到抗性品系.

1.5 酶活力测定

1.5.1 酶液制备 取10头无翅成蚜放入1.5 mL离心管，先加入250 μL预冷的0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液冰浴研磨3 min，将匀浆液在4 ℃下10 000g/min离心15 min，取上清液作为粗酶液，冰浴待用.

1.5.2 酶蛋白含量测定 测定方法参照Bradford[22]的染色法(略有改动).在试管中加入粗酶液0.1 mL再加入考马斯亮蓝G-250溶液，设置对照.置于25 ℃下恒温水浴 2 min在595 nm下测定D值，求出粗酶液蛋白含量.

1.5.3 乙酰胆碱酯酶活性测定 活性测定方法参照Gorun[23]的测定方法(略有改动).在酶标板中加入粗酶液，再加入pH 7.0磷酸缓冲液二硝基苯甲酸(DTNB)溶液和碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)溶液，在酶标仪中25 ℃条件下405 nm处读取D值变化，进而得出乙酰胆碱酯酶比活力.

1.5.4 羧酸酯酶活性测定 测定方法参照Asper-en[24]的方法(略有改进).将粗酶液加入酶标板孔中，再依次加入α-乙酸萘酯，在35 ℃条件下450 nm处读取D值变化，求得羧酸酯酶比活力.

1.6 数据分析

采用EXCEL软件进行数据统计，毒力测定结果采用SPSS16.0软件One-way ANOVA程序进行方差分析，计算LC50值，并利用Duncan氏新复极差法进行显著性分析；抗性倍数(resistance ratio，RR)=处理种群LC50/敏感种群LC50.

2 结果与分析

2.1 抗性选育结果

在抗性筛选过程中，豌豆蚜对吡虫啉的抗性检测结果见表1.由生物测定结果得出红绿色型豌豆蚜对吡虫啉的抗性随着筛选世代的增加而缓慢上升，连续筛选6代后，红绿色型豌豆蚜对吡虫啉的敏感度(LC50值)分别由选育前(F0)的0.149 2 mg/L，0.136 3 mg/L提高为选育后(F6)的0.499 0 mg/L、0.429 9 mg/L；抗性分别增长了3.34和3.15倍，红色型平均每代上升0.56倍，绿色型平均每代上升0.52倍.在生物测定过程中，不同色型豌豆蚜毒力回归方程斜率(b值)均减小，表明了不同色型豌豆蚜的群体中抗性个体会发生异质性变化而不稳定，所以豌豆蚜群体的抗性倍数有可能还会增加.

表1 豌豆蚜抗性选育结果

2.2 吡虫啉对两种色型豌豆蚜AChE比活力的影响

用吡虫啉处理后豌豆蚜体内AChE比活力变化见表2，不同色型豌豆蚜体内乙酰胆碱酯酶比活力随着选育世代的增加均有显著升高，绿色型F8代AChE比活力达到19.25 μmol/(min·mg)，活性比从1.00升高为2.98；红色型F8代AChE比活力达到23.03 μmol/(min·mg)，活性比升为4.11.通过吡虫啉处理后2种色型豌豆蚜体内AChE比活力均有所增加，表明吡虫啉对AChE比活力显著增强有关.

表2 豌豆蚜吡虫啉抗性选育过程中AChE活性变化

2.3 吡虫啉对两种色型豌豆蚜CarEs比活力的影响

豌豆蚜对吡虫啉抗性选育过程中，随着筛选代数的增加，不同色型豌豆蚜F1～F8抗性品系体内羧酸酯酶比活力均有所提高，绿色型豌豆蚜 F8代CarEs比活力升高为28.29 μmol/(min·mg)，CarEs活性比达到2.76；红色型F8代CarEs比活力达到32.03 μmol/(min·mg)，CarEs活性比为2.34.说明豌豆蚜对吡虫啉的解毒代谢与其体内解毒酶CarEs息息相关.

表3 豌豆蚜吡虫啉抗性选育过程中CarEs活性变化

3 讨论

当前，化学防治作为农业生产中害虫的主要防治措施，导致了害虫的抗药性日趋严重，为化学杀虫剂的使用带来严重的阻碍，所以明确害虫抗药性的发生规律及其机制是害虫抗药性治理的基础[25].近年来，有很多关于害虫抗药性的报道，如陈亮[26]等研究桃蚜对吡虫啉交互抗性研究，得到抗性桃蚜种群；帅霞[12]等通过对桃蚜种群世代选育，测得桃蚜种群抗性品系体内3解毒酶(碱性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶和多功能氧化酶)活性有升高的趋势；刘泽文[6]等用吡虫啉对褐飞虱进行处理，发现褐飞虱种群抗性倍数明显增加；Visetson等[27]曾研究了氯氰菊酯作用于小菜蛾后对其生长发育及体内单氧酶和酯酶活性的影响，结果表明解毒酶活性变化是小菜蛾产生抗性的重要原因；Yu等[28]研究了5种杀虫剂增效剂促进不同害虫不同虫态环氧酶活性增加；陈澄宇[29]曾研究了昆虫为适应不良环境条件其体内解毒酶活性增强，帮助昆虫代谢杀虫剂以降低危害.综上所述，可以得出昆虫解毒酶活性的变化是昆虫产生抗性的主要原因，解毒酶活性的升高促进了昆虫对杀虫剂的代谢，进而维持自身正常的生长发育.

本文所研究的豌豆蚜对吡虫啉产生抗性，绿色型F8代AChE比活力达到19.25 μmol/(min·mg)，活性比从1.00升高为2.98；CarEs比活力升高为28.29 μmol/(min·mg)，CarEs活性比达到2.76.红色型F8代AChE比活力达到23.03 μmol/(min·mg)，活性比升为4.11；CarEs比活力达到32.03 μmol/(min·mg)，CarEs活性比升为2.34；且2种解毒酶比活力均是红色型较绿色型升高更显著.此结论与常静[30]等报道的4种杀虫剂影响桃蚜AChE比活力升高的结论是一致的.但本试验仅测定了豌豆蚜抗性品系AChE和CarEs酶活性变化，而昆虫抗性产生还可能跟体内其他解毒酶活性相关，所以，为制定合理的豌豆蚜防治方案，今后还需进一步研究其体内其他解毒酶活性变化，为更深入了解豌豆蚜对吡虫啉抗性规律提供科学佐证.

4 结论

本试验通过对红绿色型豌豆蚜连续8代施用吡虫啉，测定AChE和CarEs 两种解毒酶比活力，比较红绿两种色型豌豆蚜活性比变化规律，结果表明不同色型豌豆蚜在吡虫啉抗性选育过程中随着抗性选育代数增加，其体内AChE和CarEs 两种解毒酶比活力均有所提高，说明AChE和CarEs 2种解毒酶在豌豆蚜对吡虫啉代谢解毒过程中具有十分重要的作用，但是否由于解毒酶系比活力变化而导致豌豆蚜对吡虫啉产生抗药性还需深入研究.因此，解毒酶活性升高也只是表明豌豆蚜对吡虫啉产生抗性的原因之一.